大黄酚对β?淀粉样蛋白25～35致小鼠学习记忆障碍的改善作用-临床医学论文-论文联盟
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大黄酚对β?淀粉样蛋白25～35致小鼠学习记忆障碍的改善作用
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作者：武海霞 张丹参 张力 安芳 薛贵平 王树
【摘要】 & 目的 研究大黄酚对凝聚态β?淀粉样蛋白25～35(Aβ25～35)致小鼠学习记忆障碍的改善作用,探讨其可能的作用机制。方法 采用一次性小鼠右侧脑室注射Aβ25～35 3 μl造成学习记忆障碍动物模型，避暗实验、Morris水迷宫实验观察大黄酚(0.1，1.0,10.0 mg/kg)腹腔内注射对Aβ25～35模型鼠记忆障碍的改善作用，并于侧脑室注射后17 d测定各组小鼠脑中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。结果 单侧侧脑室一次注射Aβ25～35 3 μl可引起小鼠学习记忆障碍，同时使脑组织NO含量增加和NOS、iNOS活性升高(P&0.01);而大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg,ip，17 d)可不同程度改善Aβ25～35造成的学习记忆障碍，并降低脑组织NO含量及NOS、iNOS活性(P&0.01)。结论 侧脑室注射Aβ25～35可引起小鼠学习记忆障碍，而大黄酚可能通过抑制iNOS/NO参与的在体条件下对Aβ25～35神经毒性的介导，改善Aβ25～35致小鼠学习记忆障碍。
【关键词】 & 大黄酚;β?淀粉样蛋白;学习记忆;阿尔茨海默病;一氧化氮;一氧化氮合酶
近年，越来越多的研究发现β?淀粉样蛋白(Aβ)在脑内沉积形成老年斑(SP)是阿尔茨海默病(AD)的发病基础〔1〕。以往实验表明大黄酚可抑制大鼠肝、脑过氧化脂质的生成〔2，3〕，对急性衰老小鼠记忆障碍有保护作用〔4〕，但其能否改善Aβ25～35所致的学习记忆障碍，尚未见报道。本研究通过Aβ25～35致小鼠记忆障碍并观察大黄酚的改善作用并探讨可能的作用机制。
　 　1 材料与方法
　　1.1 动物 昆明种小鼠,雄性，体重(20±2)g，鼠龄6 w， 中国
科学 院药物研究所动物实验中心提供，(动物批号：SCXK京)。分笼饲养，自由吃食和饮水，室温(20±2)℃。
　　1.2 药品和试剂 大黄酚(纯度&98%)，辽宁生物制药研究所提供，用N，N?二甲基甲酰胺溶解，吐温?80助溶，生理盐水(NS)稀释成所需浓度;Aβ25～35，购自美国Sigma公司，将1 mg Aβ25～35溶于1 ml无菌生理盐水中，密封后置于37℃培养箱中孵育1 w，使其变为凝聚状态的Aβ25～35〔5〕，-20℃保存。
　　1.3 主要仪器设备 Morris水迷宫装置，中国科学院药物研究所;SBA?2程控避暗箱，中国医学科学院药物研究所;721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;FSH?2内切式组织匀浆机，江苏环保仪器厂;80?2B离心机，上海安亭科学仪器厂;S648型恒温水浴箱，上海医疗器械七厂。
　　1.4 动物分组和给药 小鼠100只，随机分成5组：对照组，Aβ25～35模型组，大黄酚0.1、1.0、10.0 mg/kg组，每组20天。第1天，对照组侧脑室注射(icv)NS 3 μl，其他各组icv Aβ25～35 3 μl〔6〕。icv后立即ip大黄酚0.1、1.0、10.0 mg/kg，对照组、Aβ25～35模型组ip溶剂10 ml/2～17 d，各小鼠每天ip一次;8～17 d，各小鼠每天ip后60 min开始各项实验。
　　1.5 学习记忆行为学实验
　　1.5.1 避暗实验 icv后8 d，将小鼠背向洞口放入明室，同时启动程控避暗箱自动记录装置，记录180 s内小鼠进入暗室的潜伏期和错误次数，以各组小鼠进入暗室的只数与各组小鼠总只数的比值作为各组错误百分率。24 h后以同样方法记录180 s内小鼠错误次数、潜伏期和错误百分率，测验记忆成绩。
　　1.5.2 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫实验装置由一个不锈钢的圆柱形水池和一个可移动的圆柱形透明有机玻璃站台组成。水池直径120 cm，高50 cm，站台直径12 cm，高24 cm，水深25 cm，水温控制在(23±0.5)℃。水池均等分为4个象限，站台置于第一象限。水池上方的摄像机全程跟踪小鼠的活动， 计算 机记录小鼠找到站台潜伏期、游泳路径长度和搜索策略。①隐藏平台获得实验〔7〕icv后11～15 d，每只小鼠连续训练5 d，每天4次，每次采用不同的入水点训练120 s。训练时将小鼠面朝池壁轻轻放入水中，同时启动记录装置，小鼠找到站台后，让其停留20若小鼠120 s内未找到站台，则将其放于站台上站立20 s，取下休息120 s后进行下一次训练。记录120 s内小鼠寻找站台的潜伏期、游泳路径长度及所采取的搜索策略。②空间搜索实验〔8〕icv后16 d，将可移动的站台从水池中取出，水深不变。以不同的入水点训练4次。结果以小鼠120 s穿越站台所处位置的次数表示。
　　1.6 小鼠脑组织NO，NOS和iNOS含量的测定 icv后17 d，将小鼠快速断头取脑，制成10%脑匀浆。取适量上清液按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明进行NO含量、NOS、iNOS活性测定。
　　1.7 学处理 组间差异显著性用t检验，避暗实验中各组间错误百分率比较用χ2检验。
　 　2 结 果
　　2.1 Aβ25～35对小鼠避暗实验的影响及大黄酚的保护作用 结果表明：Aβ25～35可造成记忆障碍，与对照组相比小鼠进入暗室潜伏期缩短(P&0.01)，错误次数增加(P&0.01)，错误百分率增加(P&0.01);而大黄酚(0.1，1.0,10.0 mg/kg)均可不同程度地对抗Aβ25～35所致记忆障碍(表1)。表1 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠避暗实验的影响
　　2.2 Aβ25～35对小鼠Morris水迷宫实验的影响及大黄酚的保护作用 隐藏平台获得实验结果表明：Aβ25～35造成了小鼠空间学习记忆能力障碍，随着训练天数增加，Aβ25～35模型组与对照组相比潜伏期、游泳路径显著延长;而大黄酚(0.1,1.0,10.0 mg/kg)均可不同程度地改善Aβ25～35所致空间学习记忆障碍。在训练开始时，各组小鼠主要以边缘式和随机式策略寻找站台。随着训练次数逐渐增加，这两种搜索策略的出现率逐渐下降，相反趋向式和直线式搜索策略增加。空间搜索实验结果显示：Aβ25～35模型组与对照组相比穿越平台区域次数减少，有显著性差异(P&0.01);而大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg)可不同程度地改善Aβ25～35所致空间学习记忆障碍(表2)。表2 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠Morris水迷宫实验的影响与对照组比较：1)P&0.05，2)P&0.01;与模型组比较：3)P&0.05，4)P&0.01
　　2.3 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠脑组织NO含量和NOS、iNOS活性的影响 模型组小鼠脑组织NO含量增加，NOS、iNOS活性升高(P&0.01);大黄酚(0.1，1.0，10.0 mg/kg)均可降低Aβ25～35模型小鼠脑组织中NO含量及NOS、iNOS活性(P&0.01)(表3)。表3 大黄酚对Aβ25～35模型小鼠脑组织NO含量和NOS、iNOS活性的影响与对照组比较：1)P&0.01;与模型组比较：2)P&0.01
　　 3 讨 论
　　很多学者通过脑内定位注射Aβ片段来制作拟痴呆动物模型并用于药物研究，已取得可喜进展〔9〕。本研究对可溶性Aβ25～35进行了“老化”处理，并利用侧脑室注射Aβ25～35片段成功诱导了小鼠学习记忆障碍模型。
　　Aβ神经毒性作用的机制说法不一，它可能是通过氧应激、钙超载、胆碱能神经损害、免疫炎症反应等造成记忆障碍。除上述机制外，随着NO及NOS生物学研究的进展，越来越多的证据表明，NO不仅是记忆形成过程中的重要神经递质之一，而且在AD的病理机制中具有重要的作用〔10〕。NO有双相作用，其可参与某些学习过程〔11〕，但NO、NOS的增高也与学习记忆减退密切相关，可能是Aβ神经毒性作用的机制之一〔12〕。本研究显示模型小鼠脑组织NO含量增加，NOS、iNOS活性升高，表明Aβ25～35具有提高iNOS活性作用，可激发机体iNOS/NO表达异常。而大黄酚可降低小鼠脑组织中NO含量及NOS、iNOS活性，提示大黄酚发挥抗Aβ25～35神经毒性的机制可能是通过抑制iNOS与NO介导的毒性实现的。但也有研究认为Aβ的神经毒性与iNOS无明显关系，而主要与nNOS 高表达有关〔13〕。由此可见，目前关于NO、NOS在Aβ神经毒性机制中的作用尚存争议，这除与研究对象体内许多因素，如某些细胞因子、超氧化物歧化酶有关外，还可能与实验条件、方法差异有关。另有观点认为NOS的表达和活性变化是决定NO双重作用的关键〔14〕。
　　本研究通过避暗实验、Morris水迷宫实验从行为学角度观察到大黄酚(0.1、1.0、10.0 mg/kg)可不同程度改善由Aβ25～35所致的学习记忆障碍。作者已往实验研究表明，大黄酚可抑制脑乙酰胆碱酯酶(AChE)活性〔15〕，清除氧自由基〔5〕，具有抗衰老作用;从Aβ的毒性机制可以推断，大黄酚能够改善Aβ25～35模型小鼠的记忆障碍，除其抑制iNOS/NO介导Aβ25～35神经毒性之外，可能也与该药抑制脑AChE活性，清除氧自由基有关。而防止Aβ沉积，减少其神经毒性作用是预防和 治疗 AD的重要环节。因此，大黄酚有可能成为治疗AD的新型药物。
文献 】 & 　　1 Christopher J,Jacqueline P,Jo Anne M,et al.Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzhmer′s disease〔J〕.Nature,5):979?82.　　2 张丹参，张 力.大黄酚对大鼠肝过氧化脂质含量的影响〔J〕.张家口医学院学报,):1?2.　　3 王 树,薛贵平,张丹参.大黄酚对大鼠脑过氧化脂质含量的影响〔J〕.张家口医学院学报,):4.　　4 Shen LX,Li SJ，Zhang DS,et al.Effects of chrysophanol on memory impairment mice and its mechanism analysis〔J〕.Chinese Pharmacological Bulletin,):906?8.　　5 Yang SF,Yang ZQ,Zhou OX,et al.Effect of ecdysterone on the expression of c?fos in the brain of rats induced by microinjection f?AP25～35 into the hippocampus〔J〕.Acta Pharmaceutica Sinica,):241?4.　　6 Maurice T,Lockhart BP,Privat A.Amnesia incuced in mice by centrally administered β?amyloid peptides involves cholinergic dysfunction〔J〕. Brain Res,):181?93.　　7 Zhang DS,Zhang JT.Effect of total ginsenoside on memory impairment induced by β?amyloid peptide〔J〕.Chinese Pharmacological Bulletin,):422?5.　　8 Bi JZ,Cao LJ,Xu SL,et al.Protective effect of soy isoflavone on cognition disorder in Alzhmer′s disease model rats〔J〕.J Shandong Univ (Health sciences)，):920?3.　　9 Zhang J,Cheng Y,Zhang JT.Protective effect of(?)clausenamide against neurotoxicity induced by okadaic acid and β?amyloid peptide25～35〔J〕. Acta Pharmaceutica Sinica，):935?42.　　10 Nie YH,Wang LN,Ye L,et al.The study of the production of nities oxide in β?Amyloid?42 stimulated microglia in vitro〔J〕.Acad J PLA Postgrad Med Sch,?3.　　11 Xu GL,Huang YG,Zhou GQ,et al.Effects of N?arginine and nitroprusside on learning and memory in rats〔J〕.J Apoplexy Nervous Dis,):347?9.　　12 Ye J,Liu XH,Deng H.Beta?amyloid for the levels of nitric oxide in nervous tissue and antagonistic role of melatonon〔J〕.J Clin Rehabil，):7712?3.　　13 Simic G,Lucassen PJ，Krsnik Z,et al.nNOS expression in reactive astrocytes correlates with increased cell death related DNA damage in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer ′s diseased〔J〕.Exp Neurol,)：12?26.　　14 刘 辉.Alzheimer病与NO/NOS〔J〕.国外医学·神经病学及神经外科学分册,):75?7.　　15 Zhang DS,Zhang L,Xue GP,et al.Study on antisenility effect of chrysophanol 〔J〕.Chin Hosp Pharm J,):15?7.转贴于论文联盟 http://www.lwlm.com
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β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD），是以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病，是老年人中常见的一种痴呆症。它的特征性改变为：老年斑（senile plague）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）和基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons）丢失。其中老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白（amyloid β-protein,Aβ）。关于AD的发病机制仍然不是十分确定，但淀粉样蛋白级联反应假说（amyloid cascade hypothesis）是目前很多学者较为接受的一个学说。它的观点是Aβ（β淀粉样蛋白）的沉积是AD的始发因素，而纤维缠结和神经元的缺失是继发性改变。因此，针对Aβ的治疗措施将成为一种很有潜力的治疗方法。1．&&Aβ的代谢Aβ的前体蛋白APP（amyloid precursor protein），其调控基因位于21号染色体上。APP可以被至少3种蛋白酶加工，β-分泌酶的切割位点在氨基酸596和氨基酸597之间，γ-分泌酶的切割位点在氨基酸638和639之间切割，这两个酶的切割可形成完整的Aβ42。α-分泌酶在氨基酸612和613之间切割，将Aβ从之间切割形成分泌性APP形式。可以根据APP的第一步是被α或β分泌切割将其分为α-分泌酶途径和β-分泌酶途径。在α-分泌酶途径，第一步，α-分泌酶将APP的Aβ区从中间切开，第二步，γ-分泌酶作用于2个酶切位点中任一个。在β-分泌酶途径，APP首先被β-分泌酶裂解，第二步在γ-分泌酶作用下，在丙氨酸713和苏氨酸714之间位点产生Aβ42
，在缬氨酸711和异亮氨酸712之间酶切，形成Aβ40 [1]。2．&&AD发病的淀粉样蛋白级联反应假说淀粉样蛋白级联反应假说基本观点为Aβ的沉积是AD发病的始发因素，Aβ的聚集具有神经毒性。Aβ产生的增加和聚集，尤其是Aβ42 在脑组织沉积会导致形成老年斑。Aβ42 的沉积能引起神经元内Ca2＋浓度增加，激活蛋白激酶的活化，引起微管相关的tau蛋白高度磷酸化，使螺旋丝受损，继而形成纤维缠结。Aβ的沉积还能引起各种免疫炎症反应和神经毒性级联反应，引起广泛的神经元变性，甚至死亡，主要在海马和大脑皮层，出现渐进性的神经递质减少，主要是胆碱能和多巴胺能递质，最终导致记忆和认知功能障碍，产生AD症状。Aβ产生细胞损失甚至死亡的具体机制为（1）引起细胞内钙超载，使细胞内环境失衡（2）促进活性氧自由基产生，产生氧化损伤。（3）激发的免疫反应，主要是小胶质细胞和星形胶质细胞的激活释放细胞因子，产生细胞毒作用[2]。3．&&针对Aβ的六种治疗途径 由于Aβ在AD发病中起着重要作用，因此针对Aβ的措施可能成为具有潜力的AD治疗的策略。这些策略可大致分为以下六种途径： 3.1分泌酶与AD的治疗途径之一是β分泌酶途径。β-分泌酶是产生Aβ的第一个关键酶，β-分泌酶为由501个氨基酸组成的跨膜天冬氨酸蛋白酶，P93和P389两个天冬氨酸是保持活性所必须的。既能通过血脑屏障又能与β-分泌酶大型的活性位点相配合的小分子的β-分泌酶抑制剂是降低Aβ的有效方法。已经找到几个β-分泌酶抑制剂，在首个发现的β-分泌酶抑制剂基础上改造而产生新的化合物Statv，OM99-1,OM99-2,SIB1281[3]等大大提高了对β-分泌酶的抑制能力。另一种途径是γ分泌酶途径。γ分泌酶是Aβ产生的最后一步，对产生Aβ40 和Aβ42 比例起着关键作用。但由于γ-分泌酶抑制剂存在以下的问题：如对Aβ40 和Aβ42 作用存在差异，会干扰Notch信号系统等，使这类药物目前较少进入临床实验阶段。3.2&&免疫与AD的治疗以Aβ主动免疫和外周注射抗Aβ抗体的免疫治疗方法能加快Aβ清除，阻止其聚集，是针对Aβ代谢的有效的治疗方法之一。其机制之一是促进Aβ从中枢神经系统到血浆的重分布，增加Aβ从CNS的清除，而降低脑内Aβ水平，从而减少Aβ的沉积。现在已发现了Aβ中心域单克隆抗体m266,m266能迅速螯和模型鼠血浆中Aβ，使中枢产生的Aβ大量聚集在血浆中，外周长期注射m266显著减少了脑内Aβ的沉积。但m266并不与脑内已沉积的Aβ结合[4]。最近的研究发现Aβ42 疫苗接种的模型鼠的认知能力亦有提高[5]。机制之二是阻止Aβ的聚集，最近的研究发现，N末端的EFRH序列（Aβ3-6）是抗Aβ凝集抗体的特异性抗原决定簇，EFRH可调节Aβ原纤维（fibril）的形成和解聚的动力学过程。单克隆抗体6C6和10D5能抑制Aβ聚集，并能使已形成的聚合物再溶解。已经找到产生这种有效的抗Aβ聚集抗体的方法。Frenkel[6]等把表达EFRH肽段的丝状噬菌体注射给豚鼠，诱导其产生高亲和力的抗凝聚抗体。表明重组噬菌体可作为疫苗产生自身抗体治疗AD，而且由于噬菌体的高度抗原性，产生这种抗体并不需要辅剂，在三个星期内即可获得抗体，这种方法为产生有效和长效的AD疫苗提供可能性。这种主动或被动免疫形成抗体的方法可能通过激活小胶质细胞来减轻Aβ引起的神经毒性，但这种方法对于AD整个疾病进程有利还是有弊仍然不是十分清楚。在2001年底，开始了AN1792主动免疫方法的Ⅱ期临床试验，最近因为一些患者产生了严重的副反应而暂时终止了此试验。据分析，这些副反应可能是由于激活了炎症前期的级联反应所导致的[7]。3.3炎症与AD治疗炎症过程在AD发病过程所起的重要作用已经得到大量的证据证实。AD病人大脑中存在着慢性炎症过程。而Aβ沉积引发了炎性反应，Medal[8]等发现Aβ与吞噬细胞作用使促炎因子如IL-1β,IL-6和趋化性细胞因子MTP-1的mRNA明显增加，证明Aβ具有促进炎症反应的效应，Aβ沉积在脑内引起的炎症反应，造成对神经元的损伤，促成了AD的发病，因此干预炎症反应，可能成为有效的干预AD发病的方法之一。许多研究支持抗炎药物可延迟AD发生和发展，一项对55岁以上无痴呆的人群进行的前瞻性调查表明：短期服用NSAID(非固醇类抗炎药)（&1月）的人AD的相对危险度为0.95，而长期服用药（&1年）的人AD的相对危险度为0.20[9]。Lim[10]等给已出现Aβ斑块的10月龄转基因鼠服用布洛芬6个月后明显减少了IL-1β和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）水平，并且减少了Aβ沉积的数量和面积。Yagami[11]等报道了一种新的NSAID：S2474，能抑制COX-2，还具有抗氧化作用，它可阻止Aβ引起的神经元的死亡。3.4降胆固醇与AD治疗胆固醇的代谢与AD发病是相关联的。它的相关性首先体现在遗传基因上，与高水平的胆固醇相关的载脂蛋白（apoliprotein）E基因，又是AD的主要遗传危险因素。两者的相关性还体现在APP的一部分为低密度的膜部分，是由鞘脂-胆固醇组成的，而这个低密度的膜部分正是易被β分泌酶切割形成Aβ的部分，这种相关性表明Aβ的形成需要胆固醇的参与，高胆固醇与Aβ和AD之间存在内在的联系。而正是这种相关性为降低胆固醇来干预AD发病过程提供了理论依据。已经证明联合使用洛伐它汀和methyl-cycloclextin，在使细胞内胆固醇减少70％，而不影响到细胞膜完整性的情况下，使Aβ的形成减少，而分泌型的APP未受影响[12]。对豚鼠使用高剂量的辛伐它汀后，脑脊液和脑组织匀浆中Aβ40 和Aβ42 水平下降[13]。目前，降脂药能够治疗AD已经得到最近的流行病学研究的支持，流行病学资料显示：对AD病人使用降胆固醇药它汀类后发病率明显下降。3.5 金属螯合剂与AD治疗越来越多的证据表明内源性金属离子如锌、铜可能促进Aβ沉积和斑块聚集。锌铜能促使合成的Aβ在液体环境中快速沉积，可能是与Aβ中组氨酸残基结合，而且发现过渡金属铜、锌在AD病人脑中浓度增加，而且在斑块周围升高更加明显。锌转运蛋白3（zinc transporter 3 ZnT3）是将锌转运入突触间隙囊泡所必需的。已有实验证明金属锌参与了Aβ的沉积和纤维斑块的形成的过程。使用金属螯合剂不仅抑制APP2576转基因鼠的纤维斑块的聚集。而且使AD病人脑提取物中已沉积的Aβ解聚。已经发现的Cu2+/Zn2+螯合剂Clioquinol，已经进入了临床实验阶段[14]。3.6神经保护因子与AD的治疗Aβ聚集引发的神经毒性级联反应，引起的神经元变性死亡和基底前胆碱能神经元丢失，是引起AD发病的重要病理过程。因此防止Aβ沉积引起的毒性反应和神经元变性的方法是有效的改善症状的措施。胆碱脂酶抑制剂是目前唯一通过批准的药物，Tacrine, Donepezil, Rivastigmine, Galantamine均为此类,也是目前国内外用于治疗AD的主要药物。Tacrine是第一个用于临床的药物，但由于只有短期效果，且副作用大，特别是较大的肝毒性，限制了它的临床应用。Galantamine副作用较小，有较高的生物利用度等优点，使其成为治疗AD的一线药物，用于轻，中度AD的治疗，但它却不能逆转病程，只能起到缓解症状的作用[15]。最近还发现一种新型的胆碱脂酶抑制剂：Phensine，实验发现Phensine不仅保护胆碱能系统免受损害，而且减少了APP的产生，它还被证实具有改善认知能力的作用。它是通过转录后调控而减少APP水平的。目前已进入临床试验中 ，并获得一定成功[16]。4.结语β淀粉样蛋白在脑内的沉积具有神经毒性，是AD发病的始发因素之一。本文着眼于β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的关系，论述了各类针对Aβ的不同治疗途径的药物的药理机制、研发状况以及存在的问题，并阐明了开发针对Aβ的各类药物的应用前景。参考文献1.&&Esler WP, Wole MS. A portrait of Alzheimer secretase –new features and familiar faces. Science, : .2.&&Hardy J, Selkoe DJ. The Amyloid Hypotheses of Alzheimer’s disease: Progress and problems on the road to Therapeutics. Science, : 353-356.3.&&肖飞，罗焕酶.靶向β和γ分泌酶治疗阿尔茨海默病的研究进展. 国外医学药学分册，）: 272-278.4.&&Ronald BD, Kelly RB, David JC et al. Peripheral anti-A antibody alters CNS and plasma A clearance and decreases brain A burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc.Natl Acad Sci USA, ):
5.&&Morgan D, Diammond DM, Gottschall PE et al. A beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer’s disease. Nature, 15): 982-985.6.&&Fremkel D, katz O, Solomon B et al. Immunization against Alzheimer’s beta-amyloid plagues via EFRH phage administration. Proc Natl Acad Sci, USA, ): .7.&&Dodel RC, Hampel H, Du Y. et al. Immunotherapy for Alzheimer's disease. Lancet Neurol, 2003; Apr, 2(4): 215-208.&&Prat E, Baron P, Medal et al. The human astrocytoma cell line U373 MG produces monocyte chentactic protein (MCP)-1.upon stimulation with beta-amyloid protein. Neurosci Levt, ): 177-180.9.&&静雨 炎症与阿尔茨海默病. 国外医学情报, -10.10.&&Lim GP, Yang F, Chu T et al. Ibuprofen suppresses plague pathology and inflammation in a mouse model for Alzheimer’s disease. J Neurosci, 2002; (2): 571411.&&Yagami T, Vela K, Asakura K et al. Effects of S-2474, a novel nonsterodidal anti-inflammatory drug, on amyloid beta protein-induced neuronal cell death. .Br J Pharmacol, ): 673-681.12.&&Mikael. S ,Patric K, Burtape stroper. Cholesterol depletion inhibits the generation of β-amyloid in hippocampal neurons Proc Natl Acad USA, ): .13.&&Fassbebder K, Simon M, Bergmann C. Simvastatin strongly reduces levels of Alzheimer's diseaseβ-amyloid peptides A42 and A40 in vitro and in vivo Proc Natl Acad USA. ): .14.&&Joo-Yong Lee, Tohy R, Cole et al. Contribution by synaptic zinc to the gender-disparate plaque formation in human Swedish mutant APP transgenic mice. Proc Natl Acad USA, ): .15.&&吴航宇. 中枢烟碱受体与阿尔茨海默病. 国外医学老年医学分册, ，): 258-261. 16.&&Karen T Y, Show Utsukj T, Roger J et al. Phenserine regulates translation of
β-amyloid precursor protein mRNA by a putative interleukin-1 responsive element, a target for drug development. Proc Natl Acad USA. ): .
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关于丁香园尹文超, 曹云鹏
β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的新观点
-->引用本文 0
尹文超, 曹云鹏. β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的新观点[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, ): 455-458.
β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的新观点
曹云鹏&&&&
中国医科大学附属第一医院神经内科, 辽宁省沈阳市 110001
作者简介: 尹文超(1987-),女,硕士在读,主要从事Alzheimer病的研究。E-mail:。
通讯作者: 曹云鹏(1963-),男,博士,主任医师,教授,博士生导师,主要从事Alzheimer病的研究。E-mail:。
摘要: 关于β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病的关系有多种观点,新的观点认为Aβ斑与阿尔茨海默病并不相关,Aβ的生成是神经元损伤的非特异性反应,甚至认为Aβ斑沉积是阿尔茨海默病的结果。也有学者认为阿尔茨海默病的发生与Aβ状态、分布、性质的改变有关,与Aβ斑数量的增多无关。
阿尔茨海默病&&&&
β淀粉样蛋白&&&&
发病机制&&&&
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是引起痴呆的最常见原因，被认为是我们这代危害公共健康最大的疾病，其影响了超过2000万人，至2050年将约有1.35亿人患阿尔茨海默病[]。自从1906年Alois Alzheimer报道了首例阿尔茨海默病患者以来，医学工作者一直在努力探索阿尔茨海默病的病因，在阿尔茨海默病发病机制的众多学说中Aβ瀑布学说一直占主导地位。
1 Aβ瀑布学说
阿尔茨海默病典型的病理特征是细胞外β淀粉样斑块(β-amyloid plaques,Aβ斑)沉积和细胞内神经元纤维缠结。Aβ斑是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)裂解形成的β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)聚合形成，而神经元纤维缠结是由过度磷酸化的tau蛋白聚合形成。病理情况下，APP在β分泌酶和γ分泌酶的先后作用下形成Aβ，根据切割位点不同，可形成不同长度的Aβ，其中以Aβ1-40(约占90%)和Aβ1-42(约占10%)为主，目前认为Aβ1-42的毒性更强。Aβ瀑布学说认为细胞外Aβ斑的毒性作用导致了tau蛋白的过度磷酸化及神经元纤维缠结、突触损害，最终导致AD的发生。
2 对Aβ瀑布学说的质疑
大量的动物实验证明Aβ的确可以导致AD，这也是二十余年来Aβ瀑布学说一直占主导地位的原因。但目前针对Aβ免疫治疗的临床试验均以失败告终，使越来越多的学者质疑Aβ瀑布学说的正确性。
2.1 Aβ斑与痴呆不相关
如果Aβ瀑布学说是正确的，那么痴呆的严重程度应该与Aβ斑的量成正相关，而事实却并非如此，Aβ斑的密度并不随着疾病的进展而增加[]，而是一直保持稳定的状态。大约有20%～40%的正常人有AD的病理改变[]，但却没有痴呆的发生。甚至有一种非典型的AD患者，其有痴呆的临床表现，脑内海马区同AD患者一样有大量的神经元纤维缠结，却没有或只有少量的Aβ斑形成[]。早期AD患者脑内Aβ斑的沉积部位与突触损害及神经元缺失的部位不相关，早期的神经元缺失部位在内嗅皮质及海马，而Aβ斑首先在大脑皮质和杏仁核沉积[]。上述均说明Aβ斑与痴呆不相关，那么有Aβ斑的AD患者减少Aβ斑后其痴呆症状能否改善呢？Aβ42(AN1792)II期临床试验为期6年的随访发现[]，AD患者使用AN1792免疫治疗后，虽有Aβ斑的清除，但却不能阻止神经退行性变的进展，患者的痴呆程度，甚至长期生存率都没有改善。最新研发的Aβ单克隆抗体Bapineuzumab的III期临床试验同样以失败告终[]，使研究者不得不重新审视Aβ斑在AD发病机制中的作用。
2.2 Aβ的生成是神经元损伤的非特异性反应
大约30%的颅脑创伤患者脑内有一个或多个区域的Aβ沉积，同AD患者的病理表现相同，这可能是神经元损伤后的一种急性期反应，神经元损伤导致了APP的表达增多，从而导致Aβ的沉积[]。APP在维持神经元的生长及存活方面起着重要的作用，且其产物Aβ在低浓度时能够维持细胞的存活[]，促进细胞的生长[]，对抗氧自由基对神经元的损害[]。多种原因的颅脑损伤，包括颅脑手术[]、神经化学物质改变[]、脑组织缺血[]等均会引起APP的表达增多及Aβ沉积，说明上述反应是对神经元损伤的一种保护性反应，是一种非特异性的现象。包括AD在内的任何原因导致的神经元损伤后，APP的大量表达是为了维持细胞的稳定状态，同时也导致了其产物Aβ的大量产生，Aβ于细胞外沉积形成Aβ斑。目前针对Aβ的免疫治疗主要是减少Aβ的产生或者清除Aβ斑，是削弱了一种对神经元的保护作用，从而导致病情加重[]。
2.3 Aβ是AD的结果
传统的用于研究AD的转基因小鼠，如APP/PS1(表达人突变的PS1(M146L)基因和APP(KM670/671NL,V717I)基因)双转基因小鼠等，被认为是家族型AD的动物模型，其基因突变导致Aβ的生成增多，从而导致AD的发生，但也有可能是基因突变导致AD的发生，从而导致Aβ的增多[]。新近研究的一种衰老加速的非转基因大鼠(OXYS rats)与AD有相同的神经病理特征，被认为是散发型AD的动物模型，OXYS大鼠有加速衰老的特征，这种特征会使大鼠在早期发生认知功能障碍和行为异常，并伴随着突触损伤、神经元缺失、tau蛋白过度磷酸化、APP和Aβ水平升高，而Aβ沉积要晚于神经元缺失和行为异常，说明Aβ沉积可能是神经元缺失后导致的[]。
Aβ斑、tau蛋白过度磷酸化、突触损伤被认为是AD的主要病理特征，相比之下，tau蛋白过度磷酸化[]和突触损伤[]与AD的联系更为密切。tau蛋白是一种微管相关蛋白，可以调节物质经由轴突向突触传递。通过对AD转基因小鼠或AD患者的研究发现，轴突肿胀和淀粉样斑块沉积是相伴随的[]，而淀粉样斑块附近总是有磷酸化的tau蛋白相伴随[]。传统的Aβ瀑布学说认为，Aβ斑通过诱导tau蛋白过度磷酸化、突触损伤从而导致AD的发生。但也有可能是神经毒性物质诱导了tau蛋白过度磷酸化从而使其失去正常调节物质传输的功能，神经营养物质无法向突触传递，造成突触损伤，同时Aβ也无法向突触传递，便在传输功能障碍处(即tau蛋白过度磷酸化处)沉积，造成轴突肿胀。tau蛋白过度磷酸化及突触损伤才是造成AD的真正原因，而任何导致tau蛋白过度磷酸化及突触损伤的因素均可导致AD的发生，也就是说AD是一种临床症状，可以有多种病因，Aβ斑仅仅是AD患者轴突传输障碍的结果，可以用于诊断AD，而并非是AD的特异性病因。这同时也说明以过度磷酸化的tau蛋白为靶标的治疗有可能会改善AD患者的症状，目前动物实验已证明针对过度磷酸化的tau蛋白的主动及被动免疫治疗可改善转基因小鼠的认知功能和运动功能[, ]，以tau蛋白为靶标的药物治疗已进入临床试验阶段[]，部分取得可喜成果[]。
3 Aβ参与AD的发病过程
目前有众多的证据质疑Aβ瀑布学说，而支持Aβ瀑布学说的学者也在不断的修正其学说，并提出Aβ状态、分布、性质的改变才是导致AD的真正原因，而不是Aβ斑数量的增多。
3.1 Aβ寡聚体是主要毒性成分
Aβ的存在形式分为可溶性的单体、寡聚体和不溶性的纤维状斑块。Aβ单体相互聚集形成Aβ寡聚体，Aβ寡聚体进一步聚集形成Aβ斑。一种新型的APP(表达突变的APP基因)转基因鼠，可以产生大量的Aβ寡聚体，却不产生Aβ斑，8～24月龄时可以观察到tau蛋白过度磷酸化、突触可塑性降低、记忆功能损害及神经元缺失[]，说明Aβ寡聚体可以导致AD。Aβ寡聚体与细胞膜表面的受体结合[]，通过影响胞内的分子信号通路诱导炎症反应、氧化应激、tau蛋白过度磷酸化、突触损害等导致认知功能障碍。目前有多种药物可阻止Aβ寡聚体与细胞膜表面的受体结合，但迄今为止，作用于这些受体的药物对疾病的疗效却并不明确[]。
3.2 细胞内Aβ
研究发现细胞内同样存在Aβ，且细胞内Aβ的出现先于细胞外Aβ斑沉积和细胞内神经元纤维缠结，APP/PS1/TAU(表达突变的APPswe基因、PS1(M146V)基因和tau(P301L)基因，3xTg)三转基因小鼠在出现认知功能障碍时，只有海马和杏仁核细胞内有Aβ沉积，Aβ斑和神经元纤维缠结还没有出现，清除细胞内Aβ可以挽救早期的认知功能障碍，细胞内Aβ再次聚集时又可重新导致认知功能障碍[]，这强烈提示了细胞内Aβ同认知功能障碍关系密切。将Aβ注入神经细胞内，可明显抑制细胞的突触传递和长时程增强效应。阻止细胞外Aβ进入细胞内后，细胞外Aβ虽可引起突触抑制和长时程增强效应的抑制，但对突触传递和突触可塑性没有影响[]，说明细胞内Aβ对突触的损害作用更为明显。
3.3 Aβ的磷酸化
Aβ有3个磷酸化位点，包括8位、26位的丝氨酸残基和10位的酪氨酸残基。最初，在人恶性多发性畸胎瘤细胞(human embryonal carcinoma stem cells,NT-2)诱导分化的神经细胞和AD患者的脑内均发现Aβ26位丝氨酸残基的磷酸化，同时也发现细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2,cdc2)可以促进此位点的磷酸化，使用cdc2激酶的抑制剂后可以同时抑制Aβ的磷酸化和减轻Aβ引起的毒性作用[]。但后来研究最多的是8位丝氨酸残基的磷酸化，与8位磷酸化的丝氨酸特异性结合的Aβ抗体证明了AD小鼠和AD患者脑内均有磷酸化的Aβ存在，磷酸化的Aβ和非磷酸化的Aβ相比，表现出更强的聚集性和更大的毒性[]。
3.4 Aβ截断
Aβ1-40及Aβ1-42生成后会在某些作用下切去N末端的几个氨基酸形成Aβ片段，其中包括Aβ2-x、Aβ3-x、Aβ4-x、Aβ5-x、Aβ11-x等。AD患者脑内Aβ斑主要由N末端截断的Aβ片段组成，而认知功能正常的老年人脑内Aβ斑主要是由Aβ1-42组成[]。有研究表明，与Aβ1-x相比，N末端截断的Aβ片段与认知功能障碍的关系更为密切[]。
3.5 朊病毒蛋白样作用的Aβ
朊病毒蛋白(prion
protein,PrP)是一种具有传染性的蛋白，引起传递性的神经系统变性病[]。朊病毒蛋白有两种异构体，一个是具有生理作用的PrP(PrPc)，一个是具有病理作用的PrP(PrPsc)，两者只有空间构象不同。PrPc只有α螺旋结构，PrPsc则有多个β折叠结构，其溶解度低，且可抵抗蛋白酶的水解作用。分子水平Aβ与朊病毒蛋白有相似的特点，正常的Aβ为α螺旋结构，而病理作用的Aβ其β折叠结构增加，溶解度降低，易相互聚集形成Aβ斑，并可抵抗蛋白酶的作用。
最近研究显示，Aβ也有可能会像朊病毒蛋白那样传播，将Aβ注入小鼠脑内，使用生物发光成像技术于体外监测Aβ在脑内的沉积，跟踪观察近1年时间，发现外源性Aβ注入后会引起全脑Aβ沉积，破坏整个大脑结构[]。Domert等[]发现Aβ可直接在细胞间传递。以上表明，Aβ可能与朊病毒蛋白类似，会感染脑组织，但Aβ是否会像朊病毒蛋白那样具有传染性，目前还不清楚。
4 小结与展望
目前对于Aβ是否参与AD发病的核心环节仍没有定论，有越来越多的证据表明Aβ并未参与AD发病的核心环节，认为Aβ斑与阿尔茨海默病不相关，Aβ的生成是神经元损伤的非特异性反应，甚至认为Aβ斑沉积是阿尔茨海默病的结果。支持Aβ参与AD发病核心环节的学者也在逐渐修正其学说，认为Aβ状态、分布、性质的改变而非Aβ斑数量的增加才是导致AD的真正原因。随着AD患者的增加，需要更多的研究来探讨AD的发病机制，这样我们才有可能攻克这一危害人类健康的疾病。
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