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应用响应面法优化桑叶多糖_黄酮和生物碱联合提取工艺条件
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下载文档:应用响应面法优化桑叶多糖_黄酮和生物碱联合提取工艺条件.PDF槲寄生中生物碱与黄酮类化合物的提取、纯化及黄酮类化合物的生物活性研究--《南昌大学》2007年博士论文
槲寄生中生物碱与黄酮类化合物的提取、纯化及黄酮类化合物的生物活性研究
【摘要】：
槲寄生为桑寄生科(Loranthaceae)植物槲寄生(Viscum coloratum(Kom．)Nakai)的干燥茎、枝。槲寄生是我国常见的传统中草药，使用记载的历史始于秦汉时期，古代称桑上寄生，为《神农本草经》上品。但槲寄生V．coloratum(Kom．)Nakai和桑寄生Loranthus parasiticus(L．)Merr．用名较为混乱，而且由于两者功效相似及用药习惯的沿袭，临床上两者一直是混用的。从《名医别录》到《本草纲目》的一些著作中，关于桑上寄生一项大都是指槲寄生，直至近代。《中国药典》1985年版已将桑寄生和槲寄生分列开来，在其中仅收载槲寄生Viscum coloratum(Kom．)Nakai一种。我国北方诸省产的槲寄生品种单一，均为药典记载的槲寄生Viscum coloratum(Kom．)Nakai。它是以干燥的带叶茎枝入药，主要功效在于祛风湿、补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等。现代药理研究发现，槲寄生具有抗肿瘤、抑菌、抗衰老以及免疫调节等功效。
槲寄生的主要有效成分是黄酮类化合物，生物碱、粘毒素及凝集素等，但临床应用主要还是以本草或者粗提物的形式为主，影响了槲寄生的有效利用，使得我国的资源优势无法得到充分的发挥应用，故提取分离纯化槲寄生的有效成分并明确其化学结构显得尤为重要。目前，对槲寄生的研究主要集中在有关抗癌蛋白活性成分，即槲寄生毒肽和凝集素及其它们的作用机理。对槲寄生中的其它化学成分及其生物活性的研究报道比较少，到目前为止，我国北方产的槲寄生中的生物碱和黄酮类化合物的提取、分离、纯化以及产品活性的研究未见有系统的报道。因此，对我国北方产的槲寄生中的黄酮和生物碱等成分展开研究，旨在可丰富槲寄生的应用范围，为充分利用我国北方的这一丰富药材资源，开发我国自主知识产权的新药提供科学依据。
本文对槲寄生主要的活性成分黄酮及生物碱均做了较为详细的研究，为槲寄生综合利用和新药开发的研究奠定了相关的理论和应用基础。主要研究内容与所得结果如下：
1．应用现代食品分析技术，对槲寄生的基本营养成分进行了较为全面的分析。结果如下(g／100g，干重)：水分含量为9.03，灰分含量为6.07，粗纤维含量为19.65，脂肪含量为14.69，总糖含量为5.53，还原糖含量为1.98，蛋白质含量为11.29，维生素E含量为127.63μg／g。采用ICP-AES法同时测定槲寄生的微量元素，结果表明，槲寄生中含有丰富的K、Ca元素，Na、Mg的含量也相对丰富；一次煎煮液和二次煎煮液中的微量元素含量变化不大，故就微量元素而言，完全可以只煎煮一次得槲寄生煎煮液即可。
2．在对槲寄生的有效成分生物碱的研究中，采用重量法测定其含量，研究比较了酸水回流提取法、超临界CO_2萃取法、超声波辅助浸提法等不同提取方法，并对实验条件进行了正交设计试验优化，结果表明：超声波辅助浸提法中总碱的得率高于超临界CO_2萃取和传统的酸水提取法。通过正交试验确定提取的最佳工艺参数为：乙醇体积分数90％，超声时间30min，固液比1∶20，总碱的提取率可达1.73％。相比之下，超声波辅助浸提的方法简单易行，不失为一种有效的提取方法。
3．对总生物碱作了进一步分离纯化的探讨，与离子交换相比，大孔吸附树脂更适合于本体系生物碱的分离与纯化。通过对四种不同极性的大孔吸附树脂的筛选，优选出D101型大孔吸附树脂。在优化条件(上样液浓度0.288mg／mL，流速控制在4BV／h和pH10)下，总生物碱吸附率可达到3.15mg／g干树脂以上；在解吸优化条件(乙醇／水为50／50，解吸液流速控制在2BV／h)下，总生物碱解析率达到94％。
4．重点对槲寄生中主要活性成分黄酮进行了研究。采用铝盐显色可见分光光度法测定其含量，回收率为99.73％。研究比较了传统提取法、超临界CO_2萃取法、超声波辅助浸提法等不同提取方法对槲寄生总黄酮的提取，并进行了正交设计和二次旋转回归设计试验优化，对试验结果进行了统计分析或响应面分析，得到其最高得率和最优条件组合。实验结果发现，超声波辅助提取优于常规提取方法，其最佳提取条件为乙醇浓度84.72％、固液比1∶32、超声时间32.78min，在此条件下的黄酮得率为1.32％。
5．在获取黄酮粗提液后，对其纯化方法进行了探索，筛选出AB-8大孔吸附树脂对槲寄生黄酮进行分离纯化，并对AB-8树脂解吸剂的选择、上样浓度和pH值、进样速度、洗脱速度进行了研究，结果表明：当初始样液浓度为5.2mg／mL，pH值4左右时，以4BV40％乙醇作洗脱剂，上样速度2BV／h，洗脱流速1BV／h为最佳纯化条件。纯化后的样品纯度由原来的12.16％提高到69.63％，提高了5.73倍，回收率可达81.36％。
6．经显色反应和紫外光谱扫描后，初步鉴别槲寄生中黄酮类化合物的类型可能为黄酮和黄酮醇。
7．通过利用AB-8型大孔吸附树脂对提取后的总黄酮进行分步梯度洗脱，总黄酮得到了初步的分离，10％～30％乙醇洗脱液中的化合物比较多，彼此间分离效果不佳，但40％～60％乙醇洗脱液中的化合物有所减少，且分离效果尚可。对其中40％～60％乙醇洗脱液中部分黄酮类化合物进一步分离研究，采用制备型高效液相色谱，改变了两次的流动相体系，分离得到了黄酮类化合物A和B。与其他方法相比较，省时，省力，方便快捷。该两化合物分别经UV、IR、~1H NMR／~(13)C NMR以及MS相关波谱鉴定，A为高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4’-O-β-D-芹菜糖甙，B可能为高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙。
8．通过四种不同体系(油脂过氧化、DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基)研究了槲寄生黄酮的抗氧化性能。结果表明：在油脂体系中，一定浓度的槲寄生黄酮提取物对豆油的抗氧化作用强于一定浓度的Vc和BHT，与增效剂柠檬酸、Vc有良好的协同作用，且Vc的增效作用强于柠檬酸；在自由基体系中，采用分光光度法和化学发光法测定了纯化样品清除DPPH·、·OH、O_2~-·的能力。结果显示，槲寄生清除自由基性能良好，清除率与浓度成正量效关系，清除能力大小关系为：DPPH·＞·OH＞O_2~-·。
9．通过高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4’-O-β-D-芹菜糖甙对抗血小板活化因子(PAF)的作用，首次发现该化合物对PAF诱导的血小板聚集有显著抑制作用，并且呈剂量依赖关系。
【关键词】：
【学位授予单位】：南昌大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：TQ464.4【目录】：
ABSTRACT7-10
缩写语注释10-15
第一章 绪论15-31
2 槲寄生的国内外研究概况15-20
2.1 槲寄生的资源分布及植物形态15-16
2.2 槲寄生的主要化学成分16-17
2.3 槲寄生的药理学研究17-19
2.4 槲寄生的临床应用19-20
2.5 槲寄生的产品研究20
3 生物碱的研究现状20-25
3.1 生物碱的提取方法21-23
3.2 生物碱的分离与纯化方法23-24
3.3 生物碱的生物活性24-25
4. 黄酮的研究现状25-28
4.1 黄酮类化合物的提取方法25-26
4.2 黄酮类化合物的分离纯化方法26-27
4.3 黄酮类化合物的生物活性27-28
5 本研究的目的意义、主要研究内容和创新性28-31
第二章 槲寄生主要营养成分研究31-43
2 实验部分31-38
2.1 实验材料31-32
2.2 实验方法32-38
3 结果与讨论38-42
3.1 槲寄生营养成分分析38-39
3.2 微量元素的分析39-42
4 本章小结42-43
第三章 槲寄生生物碱的研究43-68
第一节 槲寄生生物碱提取工艺的研究43-56
1. 引言43-44
2 实验部分44-48
2.1 实验材料44
2.2 实验方法44-48
3. 结果与讨论48-56
3.1 生物碱的提取预实验结果48
3.2 酸水溶液回流实验结果48-50
3.3 超临界 CO_2 萃取实验结果50-53
3.4 超声波辅助浸提实验结果53-55
3.5 提取工艺的比较55-56
第二节 槲寄生生物碱的分离与纯化56-68
1 引言56-57
2 实验部分57-61
2.1 实验材料57
2.2 实验方法57-61
3 结果与讨论61-66
3.1 离子交换树脂实验结果61-63
3.2 大孔吸附树脂静态吸附与解吸试验63-64
3.3 吸附条件的优化64-65
3.4 解吸条件的优化65-66
4 本章小结66-68
第四章 槲寄生黄酮的提取与分离68-100
第一节 槲寄生黄酮提取工艺的研究68-86
1. 引言68-69
2 实验部分69-72
2.1 实验材料69
2.2 实验方法69-72
3 结果与讨论72-86
3.1 总黄酮含量测定方法的建立72-74
3.2 乙醇提取工艺的研究74-77
3.3 超临界 CO_2 萃取槲寄生总黄酮的试验结果77-80
3.4 超声波辅助提取槲寄生总黄酮的试验结果80-86
第二节 槲寄生黄酮分离纯化工艺的研究86-100
2 实验部分86-91
2.1 实验材料86-87
2.2 实验方法87-91
3 结果与讨论91-98
3.1 大孔吸附树脂分离纯化槲寄生黄酮91-96
3.2 聚酰胺树脂对槲寄生黄酮的纯化效果96
3.3 产品中总黄酮量的测定及相关参数的计算96-97
3.4 槲寄生总黄酮纯化产品的定性检测97-98
4 本章小结98-100
第五章 槲寄生黄酮的纯化与结构表征100-122
2 实验部分100-103
2.1 实验材料100-101
2.2 实验方法101-103
3 结果与讨论103-121
3.1 HPLC 色谱条件的确立103-105
3.2 大孔吸附树脂梯度洗脱黄酮的结果105-107
3.3 制备高效液相色谱分离107-111
3.4 槲寄生黄酮类化合物的结构表征111-121
4 本章小结121-122
第六章 槲寄生黄酮类化合物抗氧化和拮抗 PAF作用的研究122-134
2 实验部分122-126
2.1 实验材料123
2.2 实验方法123-126
3 结果与讨论126-133
3.1 油脂抗氧化性试验结果126-128
3.2 DPPH 自由基清除试验结果128-129
3.3 清除·OH 和O_2~-·自由基清除试验结果129-131
3.4 高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4'-O-β-D-芹菜糖甙对 PAF 诱发的血小板聚集的影响131-133
4 本章小结133-134
第七章 结论134-137
参考文献137-143
攻读博士学位期间发表的相关论文143-144
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【作者单位】：
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【基金】：
【分类号】：S567.231;R284.2【正文快照】：
0引言平贝母为百合科贝母属多年生草本植物平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim)的干燥鳞茎,又名平贝,为中国药典收载品种[1],为常用中草药,也是中国东北特产药材之一,自1977年起中国历版药典均有收载,为常用中草药,也是中国东北,尤其是黑龙江的特产药材之一[2]。《神农本
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