肉牛的肌肉脂肪和皮下脂肪中microRNA的鉴定和生物信息目标基因分析-技术前沿-新闻中心-国家标准物质网
<META content="microRNA是内源性非编码RNA，已有人提出它在身体脂肪的形成中发挥重要作用。然而，miRNA的差异表达及其牛肌肉和皮下脂肪组织的作用仍然是未知的。在这个研究中，通过基因芯片和生物学信息调查，简单描述了miRNA的差异表达及其在成年牛中肌内和皮下脂肪的靶基因分析。通过微阵列检测到的数据，鉴定了213个miRNA中的88个差异表达的，这88个中有30个miRNA在肌肉和皮下脂肪中存在显著变化（变化倍数＞1，p
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肉牛的肌肉脂肪和皮下脂肪中microRNA的鉴定和生物信息目标基因分析
【来源/作者】西北农林科技大学——张小珉 【更新日期】 13:45:59
牛的脂肪沉积通常被认为发生在三个阶段。大量的脂肪沉积首先发生在内脏和肾、胃以及邻近器官的周围，其次是肌间脂肪和皮下脂肪的沉积，并最终在肌内脂肪沉积。肌内脂肪不足和皮下脂肪过多是对牛肉品质的最大挑战。大理石纹被描述为背最长肌截面中的肌内脂肪。高等级的大理石纹是通过影响肉的口感和嫩度来提高牛肉的适口性和受欢迎程度。因此，发明一种新方法来增加大理石花纹但又不会对产量等级造成影响是非常重要的。更好地理解调节肌内和皮下脂肪组织之间脂肪的沉积和释放的不同机制，对于开发一种能够增加大理石花纹但不会对产量等级造成任何不利影响的方法是非常重要的。
miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约18-24个核苷酸。它结合到靶mRNA，从而通过抑制翻译或促进靶mRNA的降解或通过在RNA诱导的沉默复合体（RISC）提高转录翻译水平的来调节蛋白质的表达。越来越多的证据表明，miRNA在体外以及体内脂肪生成中发挥重要作用。miRNA在脂质代谢中的作用最初是在果蝇中报道， miR-14的缺失增加了甘油三酯和甘油二酯的积累量。
此后，各种研究在人类和小鼠细胞模型完成。先确定了miR-143在人前体脂肪细胞的脂肪形成的潜在作用，并表明了miR-143降低脂肪细胞分化的抑制作用。之后，在3T3-L1脂肪细胞分化中miRNA表达异形。其他的研究发现，miR-103和miRNA的簇的miR-17-92增强脂肪生成，而let-7和miR-27基因家族抑制脂肪生成。
在牛方面，已经报告了miRNA在脂肪组织中的表达谱。确定了牛的脂肪组织和乳腺腺体中的154个miRNA序列，其中54个被确定为脂肪组织特异性。此外，利用RT-qPCR分析牛的背部皮下脂肪组织中的89个miRNA的表达进行比较，18的miRNA的表达水平与背膘厚相关，其中miR-378显示了强烈的相关性。这些结果表明，微RNA在不同的物种的脂肪组织的发育，脂类代谢和脂肪细胞分化中发挥着一种调节作用。到目前为止，大多数评估miRNA在脂肪组织中作用的研究已不限于人类和小鼠细胞系，而在肉牛的脂肪细胞的miRNA研究相对滞后。本研究的目的是确定miRNA的表达谱，并深入了解miRNA在肉牛肌内脂肪和皮下脂肪沉积的潜在作用。
材料和方法
样品和RNA制备
我们的实验所用的RNA样品取自六个独立的成年肉牛的皮下脂肪和肌内脂肪。屠宰后立即取背最长肌组织块。皮下脂肪组织是通过解剖收集。肌内脂肪组织块的肌肉组织进行了解剖。皮下脂肪组织是通过解剖收集，肌内脂肪组织是通过解剖肌肉组织收集。充分注意避免污染肌肉组织和连接的肌内脂肪组织。在宰后10–20分钟内收集肌肉和皮下脂肪组织标本的碎片，并在液氮中冷冻直到RNA提取。根据制造商的说明使用的Trizol试剂抽提总RNA。总RNA的质量和浓度分别由常规琼脂糖凝胶电泳分析和分光光度法确定。
miRNA微阵列分析
微流控芯片包括749个与已知牛miRNA相对应的探针（与上市的Sanger miRBase release 19.0数据库相对应）。牛5S rRNA作为内部阳性对照；人工异源核酸puc2-20b，作为一个外部的阳性对照。完美的匹配和单碱基错配的对应于外部的阳性对照，命名为puc2pm-20b和puc2mm-20b，在探针标记前添加到RNA样品。通常PUC2PM-20B和PUC2MM-20B强度比大于10，可作为一种严格的评估方法。空白和非同源核酸作为阴性对照组。每个检测探针由一个化学修饰的与牛的microRNA互补的核苷酸编码片段和聚乙二醇间隔段。检测探针是由使用PGR（光化学试剂）化学合成的。
微阵列杂交和数据分析
微阵列实验是由服务提供商（LC-生物有限公司）进行。该法从4- 8μg总RNA样品开始，用poly（A）聚合酶的延长3'端poly（A）尾巴,然后将寡核苷酸连接到多聚（A）尾后，方便之后的荧光染料染色。在微流控芯片微型循环泵进行杂交过夜。杂交解链温度是由检测探针的化学修饰来平衡的。杂交用含有25％甲酰胺的100μL的6×SSPE buffer（0.90 M氯化钠，60mM的磷酸氢二钠，6mMEDTA，pH6.8）在34℃进行。RNA杂交后，标记荧光染料Cy3的是通过微流控芯片染料染色循环。使用激光扫描仪（GenePix4000B，分子器件）和数字化的使用数组-Pro图像分析软件（Media Cybernetics公司）收集荧光图像。
先减去背景值 ，然后使用LOWESS滤波器归一化信号（局部加权回归分析）进行数据分析。分别采用t检验计算P值和两组检测到的信号的比率（log2转化，均衡）。该值满足下列条件：比背景值较高加上3倍的标准偏差，变异系数（CV =信号的标准偏差/信号强度）小于0.5被认为是有价值的和可靠的。分层聚类由平均连接和欧几里德距离度量进行。采用P &0.01进行芯片的统计分析，它是识别肌内脂肪和皮下脂肪之间差异表达的miRNA的一个阈值。
基于它们在微阵列结果的表达模式被选定为候选差异表达miRNA（fold change &0.5，P&0.001）。实时定量PCR采用ABI PRISM&7300实时定量PCR仪进行。简言之，使用PrimeScript&miRNA的cDNA合成试剂盒，将2μg的miRNA反转录。反转录反应系统包括10 μL 2× miRNA reaction buffer(缓冲液), 2 μL 0.1% BSA（牛血清蛋白）, 2 μL miRNA PrimeScript& RT Enzyme Mix（聚合酶体系）, 2 μg of total RNA（总RNA）, 用 RNase-Free dH2O 补充至体积 20 & L。逆转录反应：37℃ 60 min，85℃ 5 s。将cDNA产物保存于-20℃。相对实时定量PCR 用SYBR& Premix Ex Taq&#8482;执行（宝生物工程有限公司，日本，DRR081A）。反应体系: 10 &L 2×SYBR&Premix Ex Taq&#8482;， 0.8 &L PCR 上游引物(10 μM),， 0.8 &L 通用下游引物(10 μM),，0.4 &L 50×ROX Reference Dye（染料），2 &L cDNA （100 ng μL&#8722;1）, 补充d H2O 至 20 &L。反应条件: 95℃3 0秒，40个循环的95℃ 5秒，60℃ 30秒和72℃ 30秒。所有反应一式三份进行。The primers for the miRNA had the same sequences as the Bos taurus miRNA with appropriate adjustments at their 5′ (Table 1). ΔΔCT法是用来确定肌内和皮下脂肪组织之间的表达水平的差异。显着性水平设定为0.05。选用 bta-let-7a 作为内参。
miRNA靶基因预测及 GO 注释和 KEGG 信号通路分析
为了理解在肌内和皮下脂肪组织中差异表达的14个miRNA的分子功能，我们使用了TargetScan40预测其靶mRNA。在当前版本TargetScan不包括被测试的普通牛的miRNA的情况下，靶基因是通过使用种子序列的自定义搜索预测。这种方法是基于这样的假设，在基因的3'端非编码区的miRNA靶位点比起在距离遥远的物种，在紧密相关的动物中具有更高的保守性。随着使用DAVID生物信息学资源，根据KEGG功能注释及miRNA调节肌内和皮下脂肪的途径，对miRNA进行分类。
所有数据均自一个一式三份的独立实验获得的。采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，研究miRNA主要通路及相互之间的作用。单因素方差分析时，各个组之间平均值的差异是由Fisher PLSD测试分析。当p&0.05时认为差异显著。
miRNA微阵列分析
我们通过对肉牛的皮下和肌内脂肪组织中的miRNA表达分析，推断那些可能参与肉牛脂肪沉积的miRNA，并对它们进行区分，看它们是参与了脂肪形成还是参与了脂肪代谢。以前的研究已经表明，对于成熟miRNA序列，使用反义RNA的短探针去量化的只有一个或几个不匹配miRNA的差异表达是不可靠的。在这项研究中，用高度相似的序列进行miRNA的表达信号数据分析，如let-7家族(let-7a, let-7b, let-7f and let-7i)。在这五个let-7 miRNA中每个样本的信号值从736到6807，miRNA表达水平具有显著差异（p&0.01），其中每个let-7 miRNA重复4个样。这些观察表明，miRNA微阵列实验的结果是敏感的和可靠的。
这个μParaflo miRNA芯片检测对749个已知的普通牛的miRNA表达谱进行了评估(miRBase 19.0, Table S1, ESI&#8224;).。微阵列数据的分析表明，88的miRNA差异表达的转录以P &在微阵列上（图1）检测出的213的miRNA0.01。微阵列数据的分析表明，213个在微阵列上（图1）检测出的miRNA有88个miRNA差异表达（P & 0.01）。这些88 miRNA中的30个miRNA在肌内和皮下脂肪之间显著改变（倍数变化&1，P &0.001，表2），其中14个miRNA的在肌内脂肪高表达（变化倍数＞1），其中miR-140，miR-143，miR-145，miR-335和mir-376e显示表达量增加2倍。16个miRNA在肌内脂肪下调（变化倍数&&#8722;1），其中mir-3613，mir-1277，mir-2359，mir-2393，mir-2325a，mir-2325c，mir-2429，mir-2452和mir-2361显示表达量2倍的减少。有14个miRNAs显示在两个样本中的表达水平不变（变化倍数＜1，P＜0.001）。miR-143，miR-145，mir-2373-5p和mir-23b-3p miR-26a在肌内脂肪中具有最高的表达信号值，而miR-26a，mir-2373-5p，mir-2325c， mir-3613 和mir-2361在皮下脂肪组织中表达水平最高（图2）。注意到，在这两个组织中，miR-26a 和 miR-2373-5p从1以很高的信号值显示出了高表达。
图1：在肉牛肌肉和皮下脂肪组织的miRNA的表达分析。该图显示了肌肉和皮下脂肪组织之间的miRNA信号差异的log2比率。在肌肉脂肪上调的miRNA显示为红色，而在肌肉脂肪中下调的miRNA显示的是绿色的。在每个图中的前4列表示在肌内脂肪的表达水平，而后四列表示在皮下脂肪相应miRNA的表达水平。(a)在芯片技术检测的213个miRNAs的热地图。(b)在肌内脂肪和皮下脂肪之间的88个miRNA差异表达的热地图（P＜0.01）。Sub =皮下脂肪；Int =肌内脂肪。
表2：通过芯片检测的在肉牛肌肉和皮下脂肪差异表达miRNA（差异表达P＜0.001）
图2：在肉牛肌肉脂肪和皮下脂肪的miRNA微阵列图像。在这个区域的图像有从(a)肌内脂肪和(b)皮下脂肪提取的miRNA 对应的探针。在Cy3标记的图像，信号强度从1增加到65535时，相应的颜色会从蓝色变成绿色、黄色和红色。(a)从肉牛肌内脂肪中提取的RNA样品中的miRNA。其中五个最高的信号值是miR-143，miR-145，miR-26a，mir-2373-5p和mir-23b-3p。(b) 从肉牛皮下脂肪中提取的RNA样品中的miRNA。其中五个最高的信号值是miR-26a，miR-2373-5P，miR-2325c，miR-3613和miR-2361。序列列表和微流控芯片的阵列布局是在。通过RT-qPCR验证选定的miRNA
为了验证微阵列和实时定量PCR数据是否相同，RT-qPCR选择了8个在肌内脂肪上调的miRNA（miR -1246，miR-140，miR-145， miR-23b -3P，miR-27b，miR-335，miR-143和miR-27a -3P）和3个在皮下脂肪上调的miRNA（miR-3613，miR-181a和miR-148A）测量它们的表达水平。bta-let-7a（在微阵列中，在肌内和皮下脂肪具有类似的信号）由于其在牛中稳定表达被用作内部对照。结果表明，这些选定的miR-1246, miR-140, miR-145, miR-23b-3p, miR-27b, miR-335, miR-143, miR-27a-3p, miR-3613, miR-181a and miR-148a，通过RT-qPCR和归一化的微阵列数据测得的表达水平是一致的(Fig. 3)。
Fig. 3通过RT-qPCR和微阵列测得的miRNA的表达。(a) 通过微阵列检测到的肌内和皮下脂肪之间差异表达的miRNA相对信号强度。(b)通过RT-qPCR检测的差异表达的miRNA的相对表达水平。(c)通过选择的11个miRNA倍数的变化比较RT-qPCR和微阵列结果。Sub =皮下脂肪，int =肌内脂肪。
miRNA目标的预测，并通过生物信息学分析功能
用TargetScan软件来预测在肌内和皮下脂肪差异表达的14个miRNA的潜在靶基因，总共有1934个假定目标被确定（数据未显示）。为了更好地理解miRNA的功能，我们提交了推定的靶基因来进行GO分析（GO Term Finder Perl module）。在肌内和皮下脂肪差异表达的14个miRNA的靶基因中，我们选出了59个与脂质代谢或脂肪细胞分化的生物学功能有关的目标基因(Tables 3 and 4)。与脂质代谢相关的miRNA的潜在靶基因的量是不同的，如miR-27b有18个预测靶基因，miRNA-3613有2个预测基因。多数人的预测的基因（59中的32个）是两个或多个miRNA的靶基因，而其中的27个预测基因是miRNA唯一的靶基因。
Table 3与脂质代谢或脂肪形成功能相关的miRNA预测靶基因
Table 4参与脂质代谢或脂肪细胞分化的目标基因功能分析
使用DAVID生物信息学资源，根据KEGG功能注释确定miRNA在脂肪组织的调节通路(Table 5)，将所预测的靶基因进行分类。有趣的是，14个在肌内和皮下差异表达的miRNA最有可能参与了3通路：MAPK信号通路，Wnt信号通路和TGF-β信号通路，这些通路可能涉及脂肪生成和代谢。虽然预测的靶基因需要在接下来的实验中进行验证，但总的来说，这些途径和生物过程分析说明差异表达的miRNA在脂肪组织生物学中可能发挥某些作用。
Table 5在肌内和皮下脂肪差异表达的14个 miRNA 的靶基因在KEGG通路的富集
脂肪细胞分化过程中的脂肪组织开始形成，并在主体出生前形成了身体的各个部分，而肌内脂肪组织是最后形成的。据之前报道，肌内脂肪组织的代谢和细胞分化水平与其他脂肪组织不同。肌内脂肪对牛肉或猪肉嫩度和风味的影响进行了讨论和研究，许多报告结果表明，肌内脂肪含量影响其适口性。肌内脂肪含量有利于肉的风味的报道，可以支持遗传研究。在这项研究中，我们评价了牛肌内和皮下脂肪之间miRNA表达的差异，并使用TargetScan软件预测差异表达的miRNA的潜在靶基因。
其中在微阵列上检测到的差异表达的miRNA，一些miRNA如miR-143，miR-27，miR-335和miR-378，已知在脂肪组织和脂肪生成过程有重要的调节功能。最丰富的miRNA，bta-miR-143（在肌内脂肪组织显著上调）潜在的靶向细胞外信号调节蛋白激酶5（ERK5），也在脂肪细胞分化中是上调的，并与肥胖相关。此外，miR-335在肌内脂肪组织是超过3.7倍上调，表明其有脂肪生物学功能。此外，最近的报告显示了miR-335在肥胖小鼠的肝和白色脂肪组织中表达是上调的，并在3T3-L1脂肪细胞中与脂肪细胞的分化标志物的表达水平密切相关。miR-27基因家族在脂肪形成中有某种作用，最近的几次观察发现，miR-27是脂肪细胞分化过程中的负调控因子，它是通过抑制PPARG（在本研究中所预测的目标之一）在人类脂肪细胞来源的干细胞和3T3-L1细胞的表达来发挥作用的。此外，miR-378在皮下脂肪明显下调（约1.6倍），是与以前在牛脂肪生成的观察一致。该报告揭示了miR-378与牛背膘厚度相关性强，在高背膘厚的脂肪组织是显著下调。因此，这些先前的研究与我们观察到的微阵列分析的miRNA表达模式一致，这表明这些保守的miRNA在其他哺乳动物调节脂肪发育和肉牛脂肪组织中的功能类似。值得注意的是，第一个牛特异的miRNA确定可与牛脂肪生成相关联。例如，miR-2393是一个牛特异的miRNA。虽然它的功能是未知的，根据生物信息学预测工具它们可以调节对应于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）基因的mRNA。未来的研究有必要了解它们在肉牛肌内和皮下脂肪沉积的作用。
在肌内和皮下脂肪都高表达的miRNA包括miR-7和miR-125b。在let-7的基因家族五名成员，包括let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和 let-7f，在肌内和皮下脂肪都检测出了高表达值。这些数据与miRNA的其他研究结果相一致，表明let-7的miRNA在小鼠脂肪细胞分化过程中上调，部分靶向转录因子High Mobility Group A2 (HMGA2).。此外， 有报道miR-125b在脂肪来源干细胞的成脂分化过程中下调。这些结果表明，这些高表达的miRNA也可以在调节肉牛脂肪组织的发育和功能中发挥作用。这些结果表明，这些高表达的miRNA也可能在调控肉牛的脂肪组织发育和功能中发挥作用。
从预测的miRNA靶基因的GO术语分析结果表明，14个差异表达的miRNA有至少两个与脂质代谢或脂肪细胞分化有关的预测靶基因。这些发现表明，这些差异表达的miRNA可能在牛脂肪组织的调节和发育中发挥作用。这些miRNA甚至可能起到更广泛的作用，例如的miR-27b上和miR-2393，它 们被预测出18和13个与调节脂质代谢或脂肪细胞分化相关的靶基因，包括PPARG，在脂肪发育和功能中发挥重要作用。功能分析表明，预测的基因筛选根据它们的脂肪组织中存在有脂质代谢和脂肪细胞形成的广泛功能。他们涉及的范围从脂质运输到脂质储存，表明miRNA可能对脂肪组织脂肪代谢有重要作用。先前使用数字基因表达标记分析的研究表明，这些基因参与脂肪细胞分化，如ACAA2, ACLY, ADIG, AGPAT4, APOO, BBS4, CAV1, CBR4, CDS2, COL4A3BP, DDHD1, DEGS1, DGAT2, DGAT2L6, ECHS1, ERO2L, FADS2, FAR2, FDFT1, FRZB, GPAM, HADHB, IAH1, ID2, LDLR, LOC782922, MBTPS1, MTTP, PC, PLA2G2D4, PLA2G4A, PPARG, PRKAG3, PTGS2, PTPLAD1, SC5DL, SCD5, SCP2, SNCA, STAR, STAT5B和TRIM32，在肉牛的皮下脂肪组织表达，它们在这次研究中属于miRNA的预测靶基因。
确定miRNA在脂肪基因调节的确切作用是一项复杂的任务，因为它们不要求完全的互补性来调节靶信使RNA。互补性是miRNA的靶标预测工具主要特征，用它来寻找miRNA靶标，因此他们可能会发现一个miRNA有数百个可能的目标。通过更多的研究，来确定在脂肪组织差异表达的miRNA的目标，将会根本性的改善我们对miRNA在牛的肌肉和皮下脂肪之间的基因调控作用的理解。此外，本研究收集的脂肪组织是由不同的细胞类型的混合物组成。因此未来的研究利用牛脂肪细胞系，可能会进一步验证miRNA在牛脂肪形成中必不可少的监管职能。
根据KEGG功能注释确定miRNA在肌内和皮下脂肪的调节通路，从而据此将14个差异表达的miRNA的预测靶基因进行了分类。在本文中，miRNA的93个目标是在MAPK信号通路的发现，这是众所周知的是密切涉及脂肪细胞分化的抑制。脂肪组织中的miRNA靶向基因的另一个途径是Wnt信号通路，这是已知的涉及脂肪细胞形成和脂肪细胞的代谢的通路。它还通过β-连环蛋白依赖性和非依赖性机制抑制脂肪形成。研究表明，Wnt信号/β-连环蛋白信号传导途径抑制脂肪细胞分化潜能，且其相关的基因在脂肪组织发育过程中似乎是依次表达。miRNA高表达的靶基因参与的另一重要途径是TGF-β信号通路，已知它涉及多个的细胞功能，如细胞增殖，凋亡，分化和迁移。值得注意的是，最近的一项研究表明，miR-21在研究中高表达，在人类脂肪组织间充质干细胞中通过调节TGF-β信号调节脂肪细胞分化。靶基因脂质生物合成过程的GO术语，脂类代谢过程，脂类储存，脂肪细胞分化，磷脂生物合成过程和磷脂的代谢过程，表明在脂肪组织差异表达的miRNA可以调节脂质代谢过程的各个方面。总的来说，通过这些途径和生物过程的分析，说明了一些差异表达的miRNA在脂肪组织生物学的可能角色。
总之，我们使用miRNA芯片评估了miRNA在成年肉牛肌内和皮下脂肪的表达模式， 并且发现miRNA的表达模式在两个脂肪组织之间是不同的。总共检测到213个miRNA，其中30个miRNA在肌内和皮下脂肪之间显著改变，表明miRNA在肉牛肌内和皮下脂肪沉积中可能起着重要的作用。我们还通过使用DAVID生物信息学资源和Term Enrichment工具，对14个差异表达的miRNA的预测靶基因进行KEGG通路 和 GO术语富集分析。鉴定脂肪组织中的一整套的miRNA的是必要的，以便更好地理解在脂肪组织的发育和生理作用中基因调控的复杂性。未来的研究，通过miRNA在肌肉和皮下脂肪组织差异表达以确定的靶mRNA，对于揭露它们的生物学功能将是至关重要的。这将被证明是有用的知识，用以在肉牛种减少脂肪组织蓄积（皮下段），同时增加脂肪形成（肌内段）。这些知识可能也适用于人类，特别是在代谢综合征，糖尿病，肥胖的调节方面。
【关键词】肉牛；肌内脂肪和皮下脂肪；miRNA；靶基因；&
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肌肉纤维类型组成对猪肉品质的影响及其机理研究
【摘要】：通过改变肌肉纤维类型组成提高猪肉品质已经成为肉品科学和养猪生产领域的研究热点。本论文首先研究猪背最长肌肌球蛋白重链（MyHC）表达的生长发育规律，确定用于分析纤维类型组成的科学指标，进一步研究肌肉纤维类型组成的品种差异及其与肉质性状的相关性，并揭示其分子机理，最后在育肥后期进行营养调控研究，为肌肉纤维类型组成在提高猪肉品质中发挥作用提供科学依据。
猪背最长肌MyHC表达的生长发育规律：选取7、40、60、120和175日龄杜长大公猪各5头，测定背最长肌MyHC蛋白表达、MyHC mRNA转录以及氧化代谢酶活性。结果显示，猪出生后生长过程中MyHC mRNA比例与相应蛋白亚基比例呈显著正相关（P0.05），MyHC I mRNA比例与琥珀酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶活性呈显著正相关（P0.05）。以MyHC I、IIa、IIx和IIb mRNA比例分别表示慢速氧化型、快速氧化型、中间型和快速酵解型纤维比例，分析表明：慢速氧化型纤维比例随日龄增加呈下降趋势，其它类型纤维比例呈升上升趋势；在7-60日龄，所有类型纤维比例变化明显；在120-175日龄，快速氧化型、中间型和快速酵解型纤维比例无显著变化（P0.05），慢速氧化型纤维比例仍显著降低（P0.05）。结果提示，MyHC mRNA组成比例可作为分析肌肉纤维类型组成的科学指标，纤维类型转化在生长早期最为明显，在育肥后期仍存在调控可能性。
猪肌肉纤维类型组成的品种差异及其与肉质性状的相关性：选择上市体重金华猪、浙江中白猪、杜浙猪和杜大长猪阉公猪各8头，分别含有100%、12.5%、6.25%和0%的金华猪血缘，以MyHC mRNA比例为指标分析背最长肌纤维类型组成，并测定肉质性状。结果显示，慢速氧化型、快速氧化型和中间型纤维比例均在金华猪表现最高（P0.05），快速酵解型纤维比例在金华猪表现最低（P0.05）；慢速氧化型纤维比例按照金华猪浙江中白猪杜浙猪杜大长猪的顺序显著降低（P0.05），快速氧化型纤维比例也表现相似趋势，但在浙江中白猪和杜浙猪之间无显著差异（P0.05）；中间型和快速酵解型纤维比例在浙江中白猪、杜浙猪和杜大长猪之间无显著差异（P0.05）；氧化型纤维比例与肉色a*值、剪切力、肌内脂肪（IMF）含量及蛋白质溶解度呈显著正相关（P0.05），与ΔpH呈显著负相关（P0.05）。结果证实了肌肉纤维类型组成的品种差异，解释了不同猪群的肉质特性，并提示在商品猪生产过程中引入一定比例优质地方血缘，有利于提高肌肉氧化型纤维比例，进而改善肉质性状。
猪肌肉纤维类型组成差异相关的能量代谢分析：以纤维类型组成明显差异的金华猪和杜大长猪背最长肌为研究对象，测定磷酸原转化指标（肌酸激酶活性与磷酸化合物含量）和糖酵解指标（糖代谢物含量和糖酵解潜力）。结果显示，高比例氧化型纤维（金华猪）肌肉具有较高的肌酸激酶（CK）活性、Cr：（Cr+CP）和肌酸（Cr）含量（P0.05），较低的磷酸肌酸（CP）、糖原、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸及乳酸含量与糖酵解潜力（P0.05）；CK活性、Cr：（Cr+CP）与均pH显著负相关（P0.05），与慢速氧化型、快速氧化型及中间型纤维比例呈显著正相关（P0.01），与快速酵解型纤维比例呈显著负相关（P0.01），葡萄糖-6-磷酸含量、糖酵解潜力均与pH、纤维类型组成的相关性表现刚好相反。结果提示：高比例氧化型纤维肌肉具有较高的磷酸原转化能力和较低的糖酵解能力，是肌肉纤维类型组成影响猪肉品质的能量代谢机理。
猪肌肉纤维类型组成差异相关的蛋白质组与基因表达谱分析：以纤维类型组成明显差异的金华猪和杜大长猪背最长肌为研究对象，利用2-DE-MS和表达谱芯片分别对肌浆蛋白和基因表达谱进行差异比较。结果显示，高比例氧化型纤维（金华猪）肌肉表现较高含量的nesprin-2-like、热休克蛋白HSP90\70\60、转铁蛋白、Gc蛋白、线粒体ATP合成酶和环腺苷蛋白激酶（PKA）（P0.05），较低含量的糖原磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶（P0.05）；高比例氧化型纤维（金华猪）肌肉中上调倍数大于3的基因分布在免疫反应、信号转导、结构成分形成、代谢调节、抗氧化、离子转运、脂类代谢、核酸代谢及氧化磷酸化等相关生物学过程，信号转导基因主要参与Jak-STAT、cAMP、TGF-β、MAPK和Wnt通路。结果提示，高比例氧化型纤维肌肉表现较强的氧化代谢、细胞骨架与结缔组织形成、线粒体ATP生成、抗氧化应激等能力，较弱的糖酵解能力，是肌肉纤维类型组成影响猪肉品质的重要分子机理；其中Wnt信号通路在氧化型纤维分化中的作用值得关注与入研究。
育肥后期猪肌肉纤维类型组成的营养调控研究：选取育肥后期（70kg体重）杜浙猪45头，平均分成3组，分别饲喂基础日粮、基础日粮+1.2%共轭亚油酸（CLA）和基础日粮+0.5%一水肌酸（CMH）。试验30天后测定生长性能、胴体性状、背最长肌纤维类型组成及肉质性状。结果显示，CLA和CMH表现促进肌肉生长、降低脂肪沉积、提高pH与肉色a*的趋势（P0.05）；CLA还显著提高慢速氧化型纤维比例、剪切力和蛋白质溶解度，显著降低滴水损失和压榨损失（P0.05）； CMH对pH的提高趋势比CLA明显，对其它肉质性状的改善程度低于CLA。在生产实际中印证了育肥后期猪肌肉纤维类型组成的可调控性，并为CLA改善肉质性状提供新的机理解释。
本论文确定了MyHC表达用于分析猪肌肉纤维类型组成的科学指标—MyHCmRNA比例，提出育肥后期猪肌肉纤维类型组成存在调控可能性，并在生产实际中得到印证。首次利用遗传基础梯度变化猪群，以MyHC mRNA比例为指标研究肌肉纤维类型组成与肉质性状的相关性，从能量代谢、肌浆蛋白质组与基因表达谱三个层次综合阐明分子机理。本文结论为优质猪肉生产、地方猪种资源利用、肉质性状营养调控提供了科学依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：S828【目录】：
摘要3-5Abstract5-13中英文缩略语对照表13-14第一章 绪论14-32 1.1 骨骼肌纤维特征与类型划分14-16
1.1.1 骨骼肌纤维的形成与特性14-15
1.1.2 基于生理形态的纤维类型划分15
1.1.3 基于酶学反应特性的纤维类型划分15-16
1.1.4 基于免疫学反应特性的纤维类型划分16
1.1.5 基于基因表达差异的纤维类型划分16 1.2 骨骼肌纤维类型组成与肉质性状的关系16-19
1.2.1 与生长性状、胴体组成的关系16-17
1.2.2 与肉质表观性状的关系17
1.2.3 与宰后肌肉能量代谢的关系17-18
1.2.4 与宰后肌肉蛋白质变性的关系18
1.2.5 与肌内脂肪（IMF）含量的关系18-19 1.3 影响骨骼肌纤维类型组成的因素19-20
1.3.1 品种和组织部位的影响19
1.3.2 生长发育阶段的影响19
1.3.3 日粮营养的影响19-20
1.3.4 神经刺激、运动训练与激素状态的影响20 1.4 决定骨骼肌纤维特征的分子机制20-23
1.4.1 决定骨骼肌纤维数目与体积大小的分子机制20-22
1.4.2 决定骨骼肌纤维类型的分子机制22-23 1.5 存在问题与本研究目的意义23-24
1.5.1 存在问题23
1.5.2 本研究目的意义23-24 参考文献24-32第二章 猪出生后生长过程中背最长肌MyHC mRNA转录与蛋白质表达的相关性研究32-46 2.1 引言32 2.2 试验材料32-33
2.2.1 试验动物与样品采集32-33
2.2.2 主要设备与仪器33
2.2.3 主要试剂33 2.3 测定项目与方法33-34
2.3.1 MyHC 蛋白亚基测定33
2.3.2 MyHC mRNA测定33-34
2.3.3 SDH和MDH活性的测定34 2.4 数据处理与统计分析34-35 2.5 结果35-39
2.5.1 MyHC mRNA含量与组成比例的生长发育规律35-36
2.5.2 MyHC 蛋白亚基含量与组成比例的生长发育规律36-38
2.5.3 SDH 和 MDH 活性的生长发育规律38
2.5.4 MyHC mRNA 转录和相应蛋白表达的相关性38-39
2.5.5 MyHC I mRNA转录与SDH、MDH活性的相关性39 2.6 讨论39-41
2.6.1 MyHC的时空表达特点39-40
2.6.2 MyHC表达用于分析肌肉纤维类型组成的研究40
2.6.3 出生后不同日龄猪的肌肉纤维类型组成变化40-41 2.7 本章小结41 参考文献41-46第三章 猪肌肉纤维类型组成的品种差异及其与肉质性状的相关性研究46-56 3.1 引言46 3.2 试验材料46-47
3.2.1 试验动物与样品采集46
3.2.2 主要仪器与设备46-47
3.2.3 主要试剂47 3.3 测定项目与方法47-48
3.3.1 肌肉纤维类型组成分析47
3.3.2 肉质性状测定47-48 3.4 数据处理与统计分析48 3.5 结果分析48-50
3.5.1 肌肉纤维类型组成比较48-49
3.5.2 肉质性状比较49
3.5.3 肌肉纤维类型组成与肉质性状的相关性分析49-50 3.6 讨论50-53
3.6.1 猪肌肉纤维类型组成的多样性特点50
3.6.2 金华猪血缘比例差异群体的肉质性状比较50-51
3.6.3 肌肉纤维类型组成与猪肉质性状的关系51-53 3.7 本章小结53 参考文献53-56第四章 猪肌肉纤维类型组成差异相关的能量代谢分析56-68 4.1 引言56 4.2 试验材料56-57
4.2.1 样品选择说明56-57
4.2.2 主要仪器与设备57
4.2.3 主要试剂57 4.3 测定项目与方法57-58
4.3.1 糖代谢物含量与肌酸激酶活性测定57
4.3.2 磷酸化合物含量测定57-58 4.4 数据处理与统计分析58 4.5 结果与讨论58-60
4.5.1 金华猪和杜长大猪背最长肌的能量代谢指标比较58-60
4.5.2 差异能量代谢指标与肉质性状的相关性60
4.5.3 差异能量代谢指标与纤维类型组成的相关性60 4.6 讨论60-63
4.6.1 宰后肌肉能量代谢特点及其与肉质性状的关系60-63
4.6.2 宰后肌肉能量代谢与纤维类型组成的关系63 4.7 本章小结63 参考文献63-68第五章 猪肌肉纤维类型组成差异相关的蛋白质组与基因表达谱分析68-84 5.1 引言68 5.2 试验材料68-69
5.2.1 样品选择说明68-69
5.2.2 主要仪器与设备69
5.2.3 主要试剂69 5.3 蛋白质组学分析69-70
5.3.1 肌浆蛋白提取69
5.3.2 肌浆蛋白的双向电泳（2DE）分离与比较69-70
5.3.3 差异蛋白质点的质谱鉴定70 5.4 基因表达谱分析70-71
5.4.1 RNA分离与纯化70
5.4.2 cDNA合成与纯化70
5.4.3 表达谱芯片检测70-71
5.4.4 数据处理71 5.5 结果71-77
5.5.1 肌浆蛋白质组的 2DE图谱比较71
5.5.2 差异蛋白质点的质谱鉴定结果71-72
5.5.3 差异表达基因的功能分类72-73
5.5.4 差异表达基因的WEGO分析73-75
5.5.5 金华猪上调倍数大于 3 的基因数量与功能分类75-76
5.5.6 细胞结构成分上调基因的功能分析76
5.5.7 信号通路上调基因的Pathway分析76-77 5.6 讨论77-79
5.6.1 关于肌浆蛋白质组比较77
5.6.2 关于细胞结构成分基因的上调表达77-78
5.6.3 关于信号通路基因的上调表达78-79 5.7 本章小结79-80 参考文献80-84第六章 CMH和CLA对肥育后期猪肌肉纤维类型组成及肉质性状的调控作用84-94 6.1 引言84 6.2 试验材料84-85
6.2.1 动物试验与样品采集84-85
6.2.2 主要仪器与设备85
6.2.3 主要试剂85 6.3 测定项目与方法85-86
6.3.1 生长性能与胴体性状测定85-86
6.3.2 肉质性状的测定86
6.3.3 肌肉纤维类型组成测定86
6.3.4 SDH和MDH活性测定86 6.4 数据处理与统计分析86 6.5 结果86-88
6.5.1 CLA和CMH对生长性能与胴体性状的影响86-87
6.5.2 CLA和CMH对背最长肌纤维类型组成、SDH和MDH活性的影响87-88
6.5.3 CLA和CMH对背最长肌肉质性状的影响88 6.6 讨论88-90
6.6.1 CLA和CMH对生长性能与胴体性状的影响88-89
6.6.2 CLA改善肉质性状机理及其对纤维类型组成的影响89
6.6.3 CMH改善肉质性状机理及其对纤维类型组成的影响89-90
6.6.4 肌肉纤维类型组成在肉质营养调控中的可能作用与机理90 6.7 本章小结90 参考文献90-94论文主要结论与展望94-96论文创新点96-98致谢98-100攻读博士学位期间发表论文100-102附录102-106
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