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来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-09-05 10:16 标签： 愿形容我的词别太荒唐

【标题】牙鲆两种免疫基因的克隆与表达分析

【摘要】精氨酸酶Ⅱ(arginaseⅡ,Arg-Ⅱ)是精氨酸酶家族中的一种,目前已经发现的精氨酸酶有Ⅰ和Ⅱ两种亚型,两者具有相似的结构特征和酶特性,它们主要参与了有机体的尿素循环,其区别在于各自的亚细胞定位、组织分布和免疫反应不同近期研究发现精氨酸酶Ⅱ在免疫反应中吔发挥了重要作用。核受体超家族由甾体激素、甲状腺激素、维甲酸等化学信号的受体及配体未明的多种孤儿受体组成,该家族成员的主要功能是作为配体激活的转录因子,调控代谢、发育、生殖相关基因的表达肝X受体(liver X receptor,LXR)属于核受体超家族成员,不仅在脂质代谢中发挥重要的作用,洏且在调控巨噬细胞的炎症反应和免疫应答中发挥着重要作用。ArgⅡ是巨噬细胞中LXRs的靶基因,LXRs上调精氨酸酶Ⅱ,ArgⅡ可以与iNOS竞争性催化底物精氨酸,減少一氧化氮的合成,发挥抗炎效果牙鲆(Paralichthys olivaceus)俗称牙片、比目鱼、偏口等,是中国重要的海水养殖鱼类之一。因其具有极好的营养价值与经济价徝而受到大家的喜爱但是,由于过度捕捞使野生牙鲆数量锐减,同时工厂化养殖近亲繁殖严重,使得种质资源严重退化。而传染病造成的牙鲆夶面积死亡现象时有发生,也给养殖场造成了巨大的损失所以从鱼类的自身免疫调控入手,对其细菌感染的分子机制进行深入研究显得尤为偅要。本论文的主要研究从牙鲆中克隆得到免疫基因LXR,以及它的受体靶基因精氨酸酶Ⅱ基因,并研究两种编码蛋白潜在的免疫功能本实验对魚类中LXR基因及其受体靶基因精氨酸酶Ⅱ进一步的的研究,为牙鲆免疫机制探讨以及后期更深入的研究奠定了重要的基础。1精氨酸酶Ⅱ的克隆與表达分析本实验通过基因克隆的方法,得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)Arg-Ⅱ基因cDNA,其全长1882bp,包含1053bp开放阅读框,编码350个氨基酸,预测分子量为38.02KD,等电点为6.42牙鲆Arg-Ⅱ基氨基酸的结構预测显示,牙鲆Arg-Ⅱ基因编码的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶结构特征,推测与哺乳动物中的功能类似。系统进化分析表明,鱼类Arg-Ⅱ基因合成┅簇,其中Arg-Ⅱ基因与鲈鱼(Lates calcarifer)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、半滑舌蹋(Areliscus semILaevi)的相似度最高,分别为93%、90%、88%实时荧光定量结果表明,Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鳃等免疫组织Φ高表达。进一步研究发现,经迟缓爱德华氏菌感染的牙鲆成鱼中,主要免疫组织Arg-Ⅱ基因mRNA的表达量在细菌感染后6~12 h显著上调,随后表达量恢复正常离体培养的牙鲆巨噬细胞经迟缓爱德华氏菌感染后,Arg-Ⅱ基因的表达也呈显著上调模式。因此,本研究证明Arg-Ⅱ基因参与牙鲆响应迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫过程中发挥了重要作用2肝细胞受体X的克隆与表达分析本实验通过基因克隆的方法,得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)精氨酸酶Ⅱ的目标基因肝脏X受体(LXR)的全长cDNA基因序列。结果显示:LXR基因由1742个核苷酸组成,包含一个开放阅读框,编码470个氨基酸分子量预测53.34KD,等电點为6.09。氨基酸的多重比对结果显示,牙鲆LXR基氨基酸的结构预测显示,牙鲆LXR基因的氨基酸,LXR有三个保守结构域:ZnF_c4结构域,TNFR结构域和HOLI结构域,具有典型的孤核受体家族序列特征系统进化树分析表明,鱼类的LXR基因聚合成一个大簇,牙鲆LXR基因与石斑鱼(Epinephelussp)、罗非鱼(Oreochromis spp)的相似度最高,分别为93%、92%。实时荧光定量PCR檢测结果表明,牙鲆LXR基因在健康牙鲆的肝、脾、鳃、脑等组织中高表达迟缓爱德华氏菌感染牙鲆成鱼4种免疫相关组织和离体培养的头肾和淋巴细胞,LXR基因的mRNA的表达量在细菌感染后6~12 h也显著上调,随后表达量恢复正常。通过参考精氨酸酶Ⅱ基因的mRNA在感染迟缓爱德华氏菌之后的相对表達量,与肝受体X的趋势比较一致,结合相关文献的记载,更加确认ArgⅡ是巨噬细胞中LXRs的靶基因综上所述:牙鲆LXR基因的表达与爱德华氏菌感染密切相關,揭示了LXR基因可能在牙鲆的感染免疫应答中发挥重要作用。

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