长非编码RNA Rian/Irm在骨骼肌发育中的功能初步研究--《哈尔滨工业大学》2015年硕士论文
长非编码RNA Rian/Irm在骨骼肌发育中的功能初步研究
【摘要】：Rian是一个母源表达的长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA),位于小鼠12号染色体,包括Irm,Meg8和AB063319三个长转录本。大量研究数据显示,其参与多种生物学过程的调控。前期研究发现,作为Rian的主要转录本,Irm在骨骼肌发育的重要时期高表达并且在骨骼肌整个发育过程中呈上升趋势,然而在骨骼肌发育成熟后其表达水平较低,这与许多骨骼肌发育的调控基因的时空表达特点相一致,提示Irm在骨骼肌发育过程中Irm在具有特殊作用。本研究以小鼠肌源性细胞系C2C12和小鼠原代骨骼肌细胞为实验材料,首先检测了Irm在体外骨骼肌细胞增殖分化过程中的表达规律;其次通过改变内源Irm的表达水平,研究其对骨骼肌细胞增殖、迁移和分化等生物学过程的影响;最后采用全基因组表达谱芯片测序的方法筛选骨骼肌发育相关的差异基因,探讨了Irm对骨骼肌细胞增殖分化可能的作用机制。形态学观察及结果分析表明,过表达Irm可以导致骨骼肌细胞增殖和迁移能力的下降,但是在一定程度上促进了骨骼肌细胞的终末端分化,同时使肌调节因子Myo D和Myogenin的表达上调;而干扰Irm则在一定程度上促进了细胞增殖和迁移,但是会明显抑制骨骼肌细胞的分化能力,并且使肌调节因子Myo D和Myogenin的表达显著下调。通过芯片数据分析及q RT-PCR验证,发现Irm表达水平的改变会影响p38 MAPK信号通路上下游基因的表达。综上所述,Irm既可以对骨骼肌细胞的增殖和迁移能力产生一定负调控作用,也可以对骨骼肌细胞的分化能力产生正调控作用,这一过程可能是通过p38 MAPK信号通路完成。这些研究结果对lnc RNA的深入研究以及为发育、疾病和进化中lnc RNA的重要性的研究提供新的依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：Q78【目录】：
摘要4-5Abstract5-9第1章 绪论9-18 1.1 课题的研究背景和目的意义9 1.2 长非编码RNA研究进展9-13
1.2.1 长非编码RNA的功能9-11
1.2.2 长非编码基因Rian与骨骼肌发育11-13 1.3 骨骼肌发育的机制13-15
1.3.1 肌肉的生成13
1.3.2 骨骼肌生长发育的分子调控机制13-14
1.3.3 骨骼肌发育过程中的重要信号通路14-15 1.4 课题的主要研究内容15-18
1.4.1 Irm基因在小鼠肌源细胞系C2C12 中的作用研究15-16
1.4.2 Irm基因在小鼠原代骨骼肌细胞中的作用研究16-17
1.4.3 技术路线17-18第2章 实验材料与方法18-25 2.1 实验材料18-19
2.1.1 实验动物和细胞系18
2.1.2 实验试剂18-19 2.2 实验仪器19 2.3 实验方法19-25
2.3.1 小鼠原代骨骼肌细胞的分离和培养19-20
2.3.2 脂质体转染细胞20
2.3.3 质粒的转化、提取和纯化20-21
2.3.4 组织总RNA提取21
2.3.5 反转录cDNA21-22
2.3.6 实时定量PCR22-23
2.3.6 Western Blot23
2.3.7 细胞周期分析23-24
2.3.8 免疫细胞化学24
2.3.9 统计学分析24-25第3章 Irm对骨骼肌细胞增殖与迁移的影响25-40 3.1 引言25 3.2 Irm在C2C12 细胞增殖分化过程中的表达分析25-27
3.2.1 C2C12 细胞的诱导分化和鉴定25-26
3.3.2 Irm在C2C12 细胞分化过程中的表达情况26-27 3.3 Irm在小鼠原代骨骼肌细胞分化过程中的表达分析27-29
3.3.1 原代骨骼肌细胞的分离及纯度鉴定27-29
3.3.2 Irm在原代骨骼肌细胞诱导分化过程中的表达29 3.4 Irm过表达载体的构建和干扰片段siRNA的设计29-31
3.4.1 Irm过表达载体的构建29-30
3.4.2 Irm干扰片段的设计30-31 3.5 过表达Irm对C2C12 细胞增殖、迁移和细胞周期的影响31-34
3.5.1 过表达Irm对C2C12 细胞增殖的影响31-32
3.5.2 过表达Irm对C2C12 细胞周期的影响32-33
3.5.3 过表达Irm对C2C12 细胞迁移的影响33-34 3.6 干扰Irm对原代骨骼肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响34-37
3.6.2 干扰Irm对原代骨骼肌细胞增殖的影响35
3.6.3 干扰Irm对原代骨骼肌细胞周期的影响35-36
3.6.4 干扰Irm对原代骨骼肌细胞迁移的影响36-37 3.7 本章讨论37-39 3.8 本章小结39-40第4章 Irm对骨骼肌细胞分化的影响及其作用40-54 4.1 引言40 4.2 过表达Irm对C2C12 细胞分化的影响40-44
4.2.1 过表达Irm对C2C12 细胞分化形态学的影响40-42
4.2.2 过表达Irm后C2C12 细胞骨骼肌marker基因检测42-44 4.3 干扰Irm对原代骨骼肌细胞分化的影响44-48
4.3.1 干扰Irm对原代骨骼肌细胞分化形态学的影响44-46
4.3.2 干扰Irm后原代成肌细胞骨骼肌marker基因检测46-48 4.4 干扰Irm后原代骨骼肌细胞全基因组表达谱分析48-50
4.4.1 测序数据质量统计结果48-49
4.4.2 已知转录本的差异表达分析49-50 4.5 本章讨论50-53 4.6 本章小结53-54结论54-55参考文献55-61附录61-62攻读硕士学位期间发表的论文及其他成果62-64致谢64
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