分子植物育种，２０１０年，第８卷，第２期，第３８８－３９２页Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０１０，Ｖ０１．８，Ｎｏ．２，３８８～３９２技术改进Ｕｐｇｒａｄｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化李明浩陈炜邢莉萍’通讯作者．ｘｉｕｅｗ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｇｎ<
br />肖进王海燕曹爱忠王秀娥’南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京。２１００９５摘要本研究以普通小麦品种扬麦１５和Ａｌｏｎｄｒａ＇ｓ的幼胚产生的愈伤组织为受体材料，通过检测ｇｕｓ基因的瞬时表达情况，研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明，在相同条件下两个品种农杆 菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦１５的最佳优化条件为：先在不添加ＡＳ的培养基中预培养，然后在菌液浓度 为ＯＤ６００＝０．２、ＡＳ浓度为１００ ｉｘｍｏＦＬ条件下侵染１０ ｍｉｎ，最后在２５℃共培养ｌ ｄ；Ａｌｏｎｄｒａ＇ｓ则在菌液浓度为 ＯＤ６００＝＝０．５、共培养时间为２ ｄ时，表现出最佳的ｇｕｓ基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。 关键词小麦，农杆菌介导，遗传转化Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａｎＡ ｇｒｏｂ ａｃ ｔｅ ｒｉｕｍ―ｍｅｄｉａｔｅｄ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ ｆｏｒ助＇ｅａｔＬｉＭｉｎｇｈａｏＣｈｅｎＷｅｉＸｉｎｇ ＬｉｐｉｎｇＸｉａｏ ＪｉｎＷａｎｇＨａｉｙａｎＣａｏ ＡｉｚｈｏｎｇＷａｎｇＸｉｕｅ‘Ｎａｔｉｏｎａｌ ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＣｒｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ’Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，ｘｉｕｅｗ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．Ｃ１１ ＩＸ）ｌ：ｉ０．３９６９／ｍｐｂ．００８．０００３８８Ｅｎｈａｎｃｅｍｖａｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｗｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００９５ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｗｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ Ｙａｎｇｍａｉ １５ａｓａｎｄＡｌｏｎｄｒａ＇ｓ ｔｏ ｂｅｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｌ＇ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔ―ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｇｕｓ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒｅｄ ｆｏｒ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｔｗｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ―ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆＹａｎｇｍａｉｔｅｒｉｕｍ１ ５ ａｌｅ：Ｆｉｒｓｔ ｐｒｅ．ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，ｔｈｅｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｆｏｒ １ ０ ｍｉｎ ｗｉｔｈ Ａ ｇｒｏｂａｃ―ａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｔａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆＯＤ卯ｏ＝０．２ａｎｄ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅａｔａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏ ｉｚｍｏｌ／Ｌ．ｆｉ＿ｎａＵｙ Ｃ，Ｏ．ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ｌ ｄａｙｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ２５℃：ａｎｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｇｕｓｔｈｅ ＣＯ．ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｏ ２ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｌｏｎｄｒａ’Ｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏ ＯＤ印０＝０．５ ａｎｄｄａｙｓ．ＴｈｉＳｗｏｒｋ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｈｅａｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ、Ⅳｈｅａｔ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ，Ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆ（｝ｒｍａｔｉｏｎ（１９９１）通过基因枪法将ｇｕｓ和ｂａｒ基因导入小麦品种 “Ｐａｖｏｎ”，在世界上首次获得了对除草剂Ｂａｓｔａ具有抗 性的转基因小麦（Ｖａｓｉｌｅｔ小麦是世界上最重要的粮食作物之一，在中国 是仅次于水稻的第二大作物。通过遗传转化可以打 破物种之间的遗传限制，利用转基因技术将外源基 因导入小麦，可以实现新品种的定向改良，从而创造 新的小麦品种（系）和种质资源（毕瑞明等，２００６；毕瑞 明，２００８；Ｌｏｒｚ ｅｔ ａ１．，１９９８）。但由于小麦基因组庞大， 小麦转基因研究２０世纪９０年代才开始起步（Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｎｅｈｒａｅｔａ１．，１９９１），随后几年小麦转基因技术得到迅速发展（葛维德等，２００７）。 目前，小麦的遗传转化中常用的为基因枪法、农 杆菌介导法和花粉管通道法等三种。Ｗｅｅｋｓ等 （１９９３）以品种“Ｂｏｂｗｈｉｔｅ”的未成熟胚为外植体，通 过基因枪法转化小麦愈伤组织并获得了可育的转ａ１．，１９９４）。Ｖａｓｉｌ等ＷＷＷ．ｍｏｌｐｌａｎｔｂｒｅｅｄ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ｌＯ．３９６９／ｍｐｂ．００８．０００３８８基金项目：本研究由国家转基因重大专项（２００８及０８００２一００１）、国家８６３项目（２００６从１０ｚｌＦ６）和高等学校学科创新引智计划ｌｌｌ项目（Ｂ０８０２５）共同资助万方数据农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ―ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒＷｈｅａｔ… …ｂａｒ基冈的小麦植株，转化效率约为０．１％￣ｏ．２％； 曾君祉等（１９９３）用花粉管通道法获得了转ｇｕｓ基因 的小麦植株，并检测到了ｇｕｓ基因的表达：Ｗｅｉｒ等（２００ １）在小麦上首次使用农杆菌介导和绿色荧光蛋白后，然后在相同条件下进行转化。当菌液浓度为 Ｏ．５时，Ａｌｏｎｄｒａ’Ｓ中的ｇｕｓ基闪瞬时表达频率最高； 而扬麦１５则在菌液浓度为ｌ时表现最高的ｇｕｓ基 因瞬时表达频率（表１）。表明小麦不同基因犁对农杆 菌的敏感性存在差异。彳ｉ同侵染时间也显著影响ｇｕｓ 基冈瞬时表达率（表２）。当侵染时间为１０ ｍｉｎ时，扬 麦１５和Ａｉｏｎｄｒａ’Ｓ都表现最高的ｇｕｓ基因表达率。ＧＦＰ相结合的方法获得了携带ＧＦＰ的转基因小 麦，转化效率约为１．８％。目前已经在多个小麦基因 型中建立了成熟小麦基因枪转化技术体系，据统计 在小麦的转基因中９０％以上都是通过基凶枪法获 得的（肖兴囝等，２０００；叶兴国等，２００１）。但是，基因 枪法具有转化效率低、成本较高、多拷贝数等缺点。 向．农杆菌介导法具有易操作、成本较低、转化效率 高以及插入拷贝数少等自身独特的优势，在小麦的 遗传转化中得到越来越广泛的重视和应用（Ｃｈｅｎｇｅｔａ１．，１９９７），建立起一个较为完善、高效的农杆菌介导的小麦遗传转化体系对于小麦基凼组研究和 转基因育种都至关重要（赵慧茹等，２００８）。但是，由 于禾本科作物特别是小麦不是农杆菌的天然宿丰， 因此，通过农杆菌携带质粒ＤＮＡ来侵染小麦细胞 组织有一定难度。Ｃｈｅｎｇ等（１９９７）首次报道利用农 杆菌法获得了转基冈小麦，随后夏光敏等也获得了 农杆菌介导的正常转基因小麦（Ｘｉａｅｔ图１ Ａｌｏｎｄｒａ’ｓ愈伤组织中ｇｕｓ基陶表达 注：左：对照：右：ｇｕｓ基㈨表达Ｆｉｇｕｒｅ ｌ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｇｕｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｏｆＡｌｏｎｄｒａ’Ｓ Ｎｏｔｅ：ＬｅＲ：ＣＫ；Ｒｉｇｈｔ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｇｕｓａ１．，１９９９）。但表ｌ荫液浓度对小麦愈伤组织中ｇｕｓ基冈瞬时表达频率的影响Ｔａｂｌｅ ｌＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘ．目前与水稻和其它双子叶植物相比，小麦的农杆菌 介导的遗传转化系统还很不成熟。本试验以小麦幼 胚愈伤组织为受体材料，通过优化预培养基、农杆 菌浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（ＡＳ）浓度及共培养 时间等影响遗传转化的主要影响冈子，为农杆菌介 导的小麦遗传转化体系的建立提供参考。ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｇｕ＇ｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃａｌｌｕｓｅｔｉｅｓｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉ－Ｉ结果与分析Ｉ．Ｉ预培养对小麦愈伤组织ｇｕｓ基因瞬时表达频率 的影响 将经过预培养的小麦幼胚愈伤组织在相同条件 下进行侵染转化，然后在无菌滤纸上共培养２ ｄ。结 果显示，部分愈伤中的ｇｕｓ基因得到表达（图１）。对于 预培养中是否添加ＡＳ对扬麦１５及Ａｌｏｎｄｒａ’Ｓ的影 响摹本一致，即在不添加ＡＳ时相对于添加会有相对 较高的ｇｕｓ基因表达率。 １．２茵液浓度及侵染时间对小麦愈伤组织ｇｕｓ基因瞬 时表达频率的影响 在农杆菌介导的遗传转化试验中，农杆菌悬浮 液浓度及侵染时间是影响遗传转化最莺要的两个因 素。愈伤组织经过不同浓度的菌液侵染及侵染时间注：同表ｌＮｏｔｅ：Ｔｈｅ ｓａｍｅａｓ注：ａ、ｂ表示０．０５显著差异水平Ｎｏｔｅ：ａ、ｂ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｏｆ０．０５ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ ｌｅｖｅｌ表２侵染时间对小麦愈伤组织中ｇｗ基冈瞬时表达频率的影响 Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎ― ｃｙ ｏｆ ｇｕ５ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓｔａｂｌｅ ｌ万方数据ｓ∞黼蕊。Ｂ删唱而降低或延长侵染时间都会使表达率降低。综合 本试验结果，小麦品种在农杆菌浓度为Ｏ．５，侵染时间 为１０ｒａｉｎ时为宜。 １．３乙酰丁香酮（ＡＳ）浓度小麦愈伤组织ｇｕｓ基因瞬时 表达频率的影响Ｔａｂｌｅ ４ｗｗｗ．ｍｏｌｐｌａａｔｂｒｅｅｄ．ｏｒｇＩＸ）Ｉ：１０．３９６９／ｍｐｂ．００８．０００３８８表４共培养时间对小麦愈伤组织中ｇ吣基因瞬时表达频率的 影响Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄＯｎｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ丘ｅ－ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｑｕｅｎｃｙ ｏｆｇｕｓ ｇｏｎｅ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ乙酰丁香酮（ＡＳ）的浓度对于小麦愈伤组织缈基因的瞬时表达率有重要的影响（表３）。除侵染液中ＡＳ浓度存在差异外，其它因素均在相同 条件下进行转化。当不添加ＡＳ时，扬麦１５及Ａｌｏｎｄｒａ＇ｓ ｇｕｓ基因瞬时表达率均最低；而加入ＡＳ后脚基因的瞬时表达率显著得到提高。这表明，在农杆菌介导的小麦遗传转化中ＡＳ起到至关重 要的作用。然而从试验中也可以发现，当ＡＳ浓度过 大时反而不利于其转化，ＡＳ的浓度以１００ ｐ，ｍｏｌ／Ｌ 为宜。 １．４共培养时间小麦愈伤组织ｂｕｓ基因瞬时表达频 率的影响 小麦愈伤组织经农杆菌侵染后，在相同条件下 共培养ｌ￣３ｄ后进行ｇｕｓ染色，结果表明（表４），当共 培养ｌｄ时，扬麦１５中的ｇｕｓ基因瞬时表达率最高； 而Ａｌｏｎｄｒａ＇ｓ中ｇｕｓ基因表达率共培养１ ｄ时仅为中 等水平，共培养２ ｄ时达到最高。当共培养时间延长 至３ ｄ时，两个品种中ｇｕｓ基因瞬时表达率均迅速下 降，这可能是由于农杆菌的过度生长布满了整个愈介导的遗传转化过程中各种影响因子的优化，可以为 以后小麦转基因育种提供高效的遗传转化技术体系。 本研究发现，在预培养培养基中加入ＡＳ，对于ｇｕｓ 基因的表达率影响不大。这可能是因为，虽然加入ＡＳ 在一定程度上可以诱导农杆菌Ｖ／ｒ基因的表达，从而增 强组织的遗传转化效率；但是，ＡＳ本身是一种酚类化 合物，具有氧化性作用，长时间与愈伤组织接触会对其 造成一定的伤害作用。所以，预培养基中是否添加ＡＳ 还要综合考虑而定。 在农杆菌介导的植物遗传转化过程中，由于受体 组织是直接浸泡在农杆菌悬浮液之中，因此，菌液浓度 以及浸泡时间与遗传转化效率有着最为直接的关系。 当菌液浓度过低时，会由于单位体积农杆菌细胞数过 少而达不到侵染效果，以至于遗传转化效率较低；当菌 液浓度过高，则会由于农杆菌细胞的过度生长而影响 受体细胞的正常生长及分化，也达不到较高的遗传转 化效率。与菌液浓度最为密切的是侵染时间，因此，需 要将两个因素综合考虑，当菌液浓度过大时，可以适当 减少受体组织侵染的时间；当菌液浓度过小时，可以适 当延长侵染时间。本研究结果表明，在小麦农杆菌转化 中，适宜的农杆菌浓度为０．５，侵染时间为１０ｍｉｎ。 农杆菌介导的植物侵染过程中，共培养时间也是 一个重要的影响因素。共培养阶段，也即农杆菌侵染受 体组织的一个阶段，共培养时间的长短也直接影响着 遗传转化效率。根据本研究结果，不同基因型最佳共培 养时间为１￣２ｄ。伤，从而抑制了愈伤的正常生长及胛基因的表达。２讨论农杆菌介导的小麦遗传转化具有独特优点，在小 麦的遗传转化中，影响其转化率的因素众多。对农杆菌表３乙酰丁香酮浓度对小麦愈伤组织中ｇｍ基因瞬时表达频 率的影响Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｅｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ０１１ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｇｕｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ ｗｈｅａｔｖａｌ＇ｌｅｔｌｅｓ３材料与方法３．１供试材料及菌株 本实验所用材料六倍体普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ他ｓ―ｔｉｖｕｍＬ．，ＡＡＢＢＤＤ）品种扬麦１５和Ａｌｏｎｄｒａ’ｓ的幼胚注：同表ｌＮｏｔｅ：１１坞ｓａｍｅａｓ均取自南京农业大学江浦试验站，两个品种均表现ｔａｂｌｅ ｌ良好的农艺性状；转基因瞬间表达采用的农杆菌菌万方数据农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｗｈｅａｔ… …株为ＣｓｓＣ。，其中含有ｐＢｌｌ２１质粒，其Ｔ―ＤＮＡ区含 有新霉素磷酸转移酶基因ｎｐｔⅡ和葡糖苷酸酶基因３．５ｇｕｓ组织化学染色及数据分析 ｇｕｓ报告基因采用组织化学染色法检测。将侵染ｇｕｓ等，均为本实验室保存。３．２小麦幼胚愈伤培养 将开花后１５ ｄ左右的扬麦１５与Ａｌｏｎｇｄｒａ’Ｓ的 幼嫩的种子经消毒后，挑取幼胚接种在诱导培养基 （ＭＳ＋２，４一Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ）ＪＺ，在气候箱内暗培养，培养温度为 （２５±１）℃，一周后形成的愈伤组织用于农杆菌侵染。 ３．３农杆菌的活化及悬浮液的制备 取保存在一７０＂Ｃ冰箱的农杆菌菌株Ｃ铝Ｃ，的甘油 菌在添加卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）５０ 平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，ＲｉＯ５０过的愈伤组织浸泡在检测液中，放置在３７。Ｃ恒温箱 过夜。用肉眼或在显微镜下即可观察到蓝色小点的 ｇｕｓ基因表达。鼬基因瞬时表达率的计算： ｇｕｓ基因瞬时表达率＝（卵＋愈伤组织数／检测愈伤组织数）ｘ１００％参考文献ＢｉＲ．Ｍ．，２００８，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ－ｕｍ―ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ ｗｈｅａｔｔｕｒｅ ｎｌａ－ｍ扎、利福ｍｇＣＬ的ＹＥＢ固体培养基上划ｅｍｂｒｙｏ，Ｓｈｅｎｇｗｕ Ｊｉｓｈｕ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１ ８（２）：５８―６０线，然后挑取单克隆放在５ ｍＬ含有上述相同抗生素 的液体培养于２８℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培养过夜。然后将菌 液转移到５０ ｍＬ的液体培养基中进行扩大培养，菌 液在３０００（毕瑞明，２００８，农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织转化的 主要凶子优化，生物技术，１８（２）：５８―６０）．Ｂｉ Ｒ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ Ｌ．Ｇ．，Ｈｏｕ Ｍ．，ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｈ．Ｇ．，２００６，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ，Ｚｈｉｗｕ Ｓｈｅｎｇｌｉｘｕｅ Ｔｏｎｇｘｕｎ（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙｒ／ｍｉｎ下离心１５－２０ ｍｉｎ，收集农杆菌，然Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），４２（３）：５７３―５７９（毕瑞明，陈后用ＷＣＣ农杆菌悬浮液将其悬浮至ＯＤ㈣所需值。 所得到的悬浮液即可用于侵染转化。 将愈伤组织置于含有ＡＳ浓度１００ ｉ－ＬｍｏＵＬ农杆 菌悬浮液的小培养皿中浸泡１５ ｍｉｎ左右，浸泡之后 挑出愈伤并用灭菌滤纸吸干多余的菌液，然后放在 含有无菌滤纸的培养皿中２５℃黑暗共培养２ ｄ。除所 进行设置的单个因素外，其它试验条件均按上述参 数进行。选取一部分共培养的愈伤组织进行ｇｕｓ组织 化学染色，每个处理取２５块，并将剩余的愈伤组织 转移到筛选培养基上继续培养。 ３．４农杆菌介导的遗传转化 预培养：将扬麦１５与Ａｌｏｎｄｒａ’ｓ的幼胚接种在诱 导培养基上，在２５℃、黑暗条件下进行预培养，分为 培养基中添加ＡＳ与不添加两种组合。 菌液浓度与侵染时间：将过夜摇菌的菌液浓度 分别设置为ＯＤ鲫＝０．２、０．５、１．０等三个梯度，然后将 含有ｇｕｓ基因的此菌液用于侵染愈伤，侵染时间分别 设为５ ｍｉｎ、１０ 件均相同。 乙酰丁香酮的浓度：在农杆菌侵染幼胚的悬浮 液中，分别添加１００ ｔｘｍｏｌ／Ｌ、２００“ｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香 酮，放置大约３０－６０ ｍｉｎ，然后用于侵染。 共培养时间：将农杆菌侵染过的愈伤组织挑出放 置在灭菌的无水滤纸上，放置在２５＂Ｃ恒温气候箱共 培养ｌｄ、２ ｍｉｎ、１５ ｍｉｎ、２０ ｍｉｎ四个梯度，其余条Ｇｅ立国，后猛，王洪刚，２００６，小麦的遗传转化，植物生理学 通讯，４２（３）：５７３．５７９）．ＣｈｅｎｇＭ．，Ｆｒｙ Ｊ．Ｅ．，Ｐａｎｇ Ｓ．，Ｚｈｏｕ Ｈ，Ｈｉｒｏｎａｋａ Ｃ．Ｍ．，Ｄｕｎｃａｎ Ｄ．＆，ＣｏｎｎｅｒＴ．Ｗ．，ａｎｄ ＷａｎＹ．，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ―ｏｌｏｇｙ，１ １５：９７１―９８０Ｗ…ＤａｎｄＮｉｕＸ…Ｇ２００７，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｓｃｉ－Ｗｈｅａｔ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｎｏｎｇｙｅ Ｋｅｘｕｅ（Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｒｅｅｓ），（２）：４０－４３（葛维德，钮旭光，２００７，小麦转基因技术 研究进展，辽宁农业科学，（２）：４０－４３）Ｌｏｒｚ Ｈ．，Ｂｅｃｋｅｒ Ｄ．，ａｎｄ Ｌｕｔｔｉｃｋｅ Ｓ．，１ ９９８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｈｅａｔｂｒｅｅｄｉｎｇ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ Ｉ／ａｎｓｆｃｒ，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１００：２１９－２２２ ＮｅｈｒａＮ．Ｓ．，Ｃｈｉｂｂａｒ Ｒ．Ｎ．，Ｌｅｎｎｇ Ｎ．，Ｃａｓｗｅｌｌ ｋ，Ｍａｌｌａｒｄ Ｃ．。 Ｍ．，ａｎｄ Ｋａｒｔｈａ ｋｋ，１９９４，Ｓｅｌｆ－ｆｅｒｔｉｌｅＳｔｅｍｈａｕｅｒ Ｌ．，Ｂａｇａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｉｓｓｕｅｓ ｆｏｉｌｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ ｏｗｉｎｇｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｃｕｔｅｌｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｗｏｍｉｃｍｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔＪｏｕｒｎａｌ，５：２８５?２９７ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅ Ｖａｓｉｌ Ｖ．，Ｂｒｏｗｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ＰｌａｎｔＳ．Ｍ．，Ｒｅ Ｄ．，Ｆｒｏｍｍ Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ Ｉ．Ｋ．。１９９１。 ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｅｔｉｌｅ ｂｏｍ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｗｈｅａｔ，ＮａｔｕｒｅＳｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｌｉｎｅｓｂａｒｄｍｅｎｔｏｆ ｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：７４３－７４７ Ｖａｓｉｌ Ｖ．。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｖ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ ＩＣ，１ ９９３，Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅｃｔＡ．Ｍ．，Ｆｒｏｍｍ Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖ勰ｉｌＩ．ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｄｉ－ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｌｍｏｉｏｇｙ．１ｌ：１５５３―１５５８Ｗｅｅｋｓ Ｊ．Ｔ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｏ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｌｅｃｈｌｔｉｏｎ ｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅＡ．Ｅ．，１９９３，Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃ。ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｉｎｅｓ ｏｆｆｅｒｔｉｌｅ ｎａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０２：１０７７―１０８４ Ｗｅｉｒ Ｂ．，Ｇｕ Ｘ．，Ｗａｎｇ Ｍ．Ｂ．，ＵｐａｄｈｙａｙａＮ．，Ｅｌｌｉｏｔｔｄ和３ｄ。Ａ．Ｒ，ａｎｄ万方数据ｓ９２慧篡警黧。…唱ＢｒｅｔｔｅｌｌＲ，２００１。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｉｌｓ．ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ａＳ ａｎｄ ｇｒｅｅｎａｗⅥｗ．ｍｏｌｐｌａｎｔｂｒｅｅｄ．ｏｒｇＤＯＩ：１０．３９６９／ｍｐｂ．００８．０００３８８ｔｉａ ＡｇｒｉｃｕｉｔｕｒａＳｉｎｉｃａ），３似５）：４６９－４７４（叶兴国，Ｓｈｉｒｌｅｙ Ｓａｔｏ，ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ徐惠君，杜丽璞，Ｔｏｍ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，２００１，小麦农杆菌介导转 基因植株的稳定获得和检测，中国农业科学，３４（５）： ４６９－４７４）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｓａｖｉｓｕａｌ ｍａｒｋｅｒ，Ａｕｓ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ０１．，２８：８０７－８１ ８ＸｉａＧ．Ｍ．，ＬｉＺ…ＹＨｅＣ．）（．，Ｃｈｅｎ Ｈ．Ｍ．，ａｎｄＢｒｅｔｔｅｌｌ １Ｌ，１９９９，ＺｅｎｇＪ．Ｚ．，Ｗａｎｇ Ｄ．Ｊ．，Ｗｕ Ｙ．Ｑ．，Ｚｈａｎｇ ａｎｄＪ．，ＺｈｏｕＷ．Ｊ．，Ｚｈｕ Ｘ．Ｐ．， ｐｌａｎｔｓ ｂｙｉｎ ＣｈｉｎａＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ（Ｔｎｔｋｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍＸｕ Ｎ．Ｚ．，１ ９９３，Ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔＬ）Ｍｅｄｉａｔｅｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅａ Ｘｉａｏｂｙ Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ＡｃｔａＰｈｏｔｏ－ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ ｐａｔｈｗａｙ，ＺｈｏｎｇｇｕｏＫｅｘｕｅ（ＳｃｉｅｎｃｅＳｉｎｉｃａ，２５（１）：２２―２８ Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎｉｅ Ｘ．Ｌ．，２０００，Ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ）），２３（３）：２５６．２６２（曾君祉，王东江，吴有强，张健， 周文娟，朱小平，徐乃正，１９９３，用花粉管途径获得小麦转 基冈植株，中国科学（Ｂ辑），２３０）：２５６―２６２）Ｚｈａｏ Ｈ．Ｒ．，Ｇｕ Ｙ．Ｈ．，Ｊｉａｏ Ｚ．，ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＸ…ＧＺｈａｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ａｄｖａｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｎｏｎｇｙｅ Ｓｈｅｎｇｗｕ―ｊｉｓｈｕ Ｘｕｅｂａｏ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ），８（２）：ＱｉｎＧ．Ｙ．，２００８，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｉｎｔｏ１１１－１１６（肖兴国，张爱明，聂秀玲，２０００，转基冈小麦的研 究进展与展望，农业生物技术学报，８（２）：ｌｌ １．１１６）Ｙｅ Ｘ．Ｇ．，Ｓａｔｏ Ｓ．，Ｘｕ Ｈ．Ｊ．，Ｄｕ Ｌ．Ｐ．，ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ Ｔ．，２００１， Ｒｅｇｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａ― ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｗｈｅａｔ ｃａｌｌｕｓ．Ａｎｈｕｉ Ｎｏｎｇｙｅ Ｋｅｘｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅＯｏｕｒｒｍｉｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ―Ｓｃｉｅｎｃｅ），３６（２３）：９８８５－９８８７（赵慧茹，谷运红，焦浈，秦广雍，２００８，农杆菌介导小麦遗传转化的影响因素，安徽 农业科学，３６（２３）：９８８５．９８８７）ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓ，ＺｈｏｎｇｇｕｏＮｏｎｇｙｅＫｅｘｕｅ（Ｓｃｉｅｎ－肇窜审审审肇Ｗ肇第艇篁藿望肇第审审肇肇窜审审氅窜叼节窜窜审窜肇审窜审第望第窜审审审审审肇链印度农业研究委员会希望获得研究黄金稻的自由ＩＣＡＲ ｗａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｈａｎｄｏｎＧｏｌｄｅｎ Ｒｉｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ印度农业研究委员会（ＩＣＡＲ）有可能结束黄金稻研究。此委员会从属于联邦农业部，它写信给先正达公 司（一个农商公司）和人道主义委员会，请他们允许它不受限制在印度做相关研究。先正达公司的一个小组有 望在下个月抵达印度，讨论这个议题。如果印度农业研究委员会被允许它寻求的自由，那么稻米的技术研究 将飞速发展。作物科学厅副厅长ＳｗａｐａｎＫｕｍａｒＤａｔｔａ教授表示印度公共研究院有能力引导安全试验田，并实施生物安全测试，并请求拥有黄金稻技术和黄金稻委员会的先正达允许。 原先在苏黎世黄金稻研究中心，后来在国际水稻研究所工作的Ｄａｔｔａ教授，在菲律宾群岛的ＡｃｈａｒｙａＮ．Ｇ．Ｒａｎｇａ农业大学召开为期３天与“基凶组与作物发展――关联与保护’，相关的研讨会。随着全球对高额许可费用的疾呼，先正达同意免费授权发展中国家照顾部分贫网人的需求。不过，在一定量后，就要支付许可费了。 尽管先正达提供了免费技术，但委员会却制定了严格的研究方案。Ｄａｔｔａ教授说：“我们也得到这项技术， 但委员会实在太谨慎了。这种严格的管理机制花费了太多时间。如果我们可以选择我们所拥有的材料，那将 加速试验田与安全测试的管理。印度的公共研究是首屈一指的，安全试验在向农民提供种子前将得以保证。” 这种稻可以在全球几个缺乏维Ａ的地区满足人们对其的需求。缺乏维生素Ａ会导致成千上万人失明，他们 认为这种转基因水稻将弥补这种缺陷。关于反对生物技术作物的，Ｄａｔｔａ教授明确表示没有任何不同部委间 的冲突，“如果你能很好的阅读环境部部长的报告，你能明确他并不反对研究和科学之意。”他指出在转基 因水稻、白菜和一些蔬菜作物上进行的试验将继续进行。编译者：陈游，本刊通讯员ＤＯＩ：１ ０．３９６９／ｍｐｂ．００８．０００３９２本文引用格式：陈游，２０１０，印度农业研究委员会希望获得研究黄金稻的自由，分子植物育种，８（２）：３９２ 信息来源：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｈｉｎｄｕｂｕｓｉｎｅｓｓｌｉｎｅ．ｃｏｍ／２０１０／０２／２６／ｓｔｏｒｉｅｓ／２０１００２２６５１５６２０００．ｈｔｍ万方数据
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