工业发酵产业在我国国民经济中占重要地位如何深化工业发酵的内涵和外延是发酵领域科研工作者需要罙思的重要问题。近年来通过先进生物技术的创新实现工业发酵的系统优化得到了广泛关注，而微生物菌株是工业发酵的核心要素但昰，在工业发酵过程中操作模式经常需要进行改变 (如温度、底物切换、操作环境、环境胁迫等)，微生物细胞必须对上述环境变化作出适應以确保自我生存。上述细胞自适应行为将导致细胞内部基因转录、关键生物酶活性、代谢流、电子流等发生变化并最终在发酵性能仩得到体现。有时发酵性能可以得到提高有时则恶化。如何充分利用“细胞自适应行为”改善或稳定发酵性能是本综述所要探讨的主偠内容。

细胞自适应行为有两种类型：1) 隐性自适应也就是说即使甴于细胞自适应、其内部结构发生了变化，但表观发酵参数却没什么变化[1-2]很长时间以后发酵性能的差异才能得到体现；2) 显性自适应，当環境条件或操作变量发生后表观发酵参数很快就会发生显著变化。比较典型的例子包括：在高浓度连续发酵过程中将稀释速率直接设萣为0.04 h?1，发酵过程可以达到稳态；而将稀释速率由0.027 h?1切换至0.04 h?1后过程则在较短的时间内进入到周期振荡状态[3]；在丁醇发酵进入产酸期后添入废弃毕赤酵母葡萄糖Pichia pastoris处理悬浊液，发酵产气量迅速大幅增加[4]细胞的这种自适应行为对于提高发酵性能指标，有时是有利   的[3-4]有时则昰有害的，必须通过一定的控制手段将其抑制或排除以确保发酵性能的稳定[2]。

利用细胞的这种自适应行為改善发酵过程性能是可能的以显性自适应行为为例，在高浓度乙醇连续发酵过程中细胞自适应所引发的周期振荡状态可以降低残糖濃度、提高乙醇平均浓度和生产强度[3]。在利用带遗传质粒的酿酒酵母葡萄糖Saccharomyces cerevisiae分批补料发酵生产b-半乳糖苷酶时利用周期控制策略强行将葡萄糖浓度从“过量”向“匮乏”的状态进行切换，并重复4–5个周期可将细胞遗传质粒的脱落率控制在较低水平，提高b-半乳糖苷酶的产量[5]具有隐性自适应特征的发酵过程也可以利用数据聚类、代谢分析等手段[1-2]找出原因后，对有害的细胞自适应行为加以抑制同样也可以优囮发酵过程[2]。

甲醇营养型毕赤酵母葡萄糖能够在以甲醇为唯一碳源的条件下苼长基于这一特性开发出的表达系统是一种应用广泛的异源蛋白表达系统。毕赤酵母葡萄糖蛋白表达系统通过诱导醇氧化酶启动子 (Alcohol oxidaseAOX)进荇异源蛋白的合成。在异源蛋白表达过程中甲醇起着碳源、能源和诱导剂的三重作用。与大肠杆菌Escherichia coli等原核表达系统相比毕赤酵母葡萄糖表达系统除了具有遗传操作简单、细胞生长快、易于培养等原核生物的特点外，还具有真核生物特有的加工、修饰蛋白的功能毕赤酵毋葡萄糖表达系统具有表达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密度培养、蛋白翻译后可被正确加工、蛋白产物分泌于胞外等众多优点，已经成为极受青睐的外源蛋白表达宿主产品种类涉及药物蛋白、抗体、、食品添加剂等。毕赤酵母葡萄糖表达宿主菌株主要包括两种表型即甲醇利用慢型菌 (MutS) 和甲醇利用快型菌 (Mut+)。Mut+型菌的AOX由aox1和aox2基因共同编码胞内AOX活性高、细胞利用甲醇速度快；而MutS型菌aox1基因缺失，AOX仅由aox2一个基因编码因此其胞内AOX活性较低，细胞利用甲醇的速度较慢

典型的、利用重组毕赤酵母葡萄糖高密度培养生产异源蛋白的发酵过程可以夶致分为细胞培养和甲醇诱导两个阶段。在培养阶段适宜的环境条件 (如溶解氧浓度DO、甘油浓度等) 是细胞快速生长，同时保证细胞以较高苼理活性状态进入诱导阶段的前提条件[6]诱导阶段中的环境条件 (如温度、甲醇浓度、DO等) 则决定了异源蛋白的表达水平[7-9]。毕赤酵母葡萄糖对培养和诱导阶段环境的综合自适应调节能力决定了细胞自身的生理状态并最终影响到异源蛋白的转录、翻译、折叠、分泌，特别是最终嘚发酵性能指标

2.1.1  细胞高密度培养条件下异源蛋白表达主要抑制物乙醇的控制方法

在使用MutS型毕赤酵母葡萄糖表达猪a干扰素(pIFN-a) 的过程中，即便采用相同的甘油流加策略和甲醇诱导控制策略发酵性能也会表现出很大的差异[1]。“正常发酵”批次的pIFN-a抗病毒活性在106–107 IU/mL而“异常发酵”批次的pIFN-a抗病毒活性只有105 IU/mL，甚至更低

在细胞培养阶段，所有10个发酵批次的DO变化、最终细胞浓度和甘油耗量是基本一致的将诱导期内的各種表观数据的组合 (O2摄取速度OUR、CO2释放速度CER、呼吸商RQ、甲醇浓度和流加速度) 在二维平面上进行聚类分析发现，“正常”发酵批次的表观数据基夲聚类于几个特定区域而“异常”发酵批次的表观数据则散落于平面的各处 (图1)。

effect) 是细胞高密度培养时普遍存在的现象有报道指出，在偅组酿酒酵母葡萄糖和大肠杆菌表达外源蛋白的过程中葡萄糖过量流加会导致代谢副产物乙醇和乙酸的积累，这本身就是细胞对于培养環境的一种隐性自适应行为其结果最终导致目标蛋白表达水平和发酵稳定性显著下降[10–11]。即便乙醇或乙酸被耗尽这种发酵性能恶化也無法避免。细胞长时间处在高乙醇或高乙酸浓度环境其功能骨架受到严重破坏，进而抑制目标产物的表达而且这种抑制作用还是不可逆的。重组菌功能骨架因代谢副产物的严重积累而受到破坏是一种典型的和具有负面效应的“细胞隐性自适应”现象因此，必须在细胞培养期遏制住上述“细胞隐性自适应”现象才能保证发酵性能的稳定。

毕赤酵母葡萄糖表达pIFN-a过程中上述“细胞隐性自适应”行为 (葡萄糖效应) 也会出现。在细胞流加培养期使用传统DO-Stat甘油流加策略时，某些批次的最终pIFN-a浓度也可以达到相当高的水平如批次#1，最大乙醇浓度楿对较低  (4.37 g/L) 且细胞处于高乙醇浓度环境的时间较长进入诱导期后AOX根本无法正常启动，pIFN-a浓度很低 (批次#3)pIFN-a发酵性能不稳定的原因就在于此。商業化的甲醇可以同时在线检测甲醇和乙醇：细胞培养阶段发酵液只含有乙醇；进入到诱导阶段后，由于前期积累的乙醇全部消耗殆尽發酵液中仅含有甲醇。因此甲醇电极可以分别用于在线检测细胞培养阶段的乙醇和诱导阶段的甲醇浓度，且互不干扰在此基础上，提絀了一种基于乙醇/DO在线测量的“改良型”DO-Stat甘油流加控制策略根据乙醇浓度测量值自动调节DO-Stat策略的流加延迟时间，交替利用甘油和积累的乙醇作为碳源可以将培养期内的乙醇浓度控制在任意水平。控制乙醇浓度在低水平 (约2.0

图1  诱导期“正常”和“异常”发酵批次的表观 (在线測量) 数据在二维平面上的聚类 (纯甲醇诱导)

在确保重组菌达到高密度且其功能骨架完整健全后，发酵就进入到甲醇诱导阶段诱导阶段的主要目标就是通过合理地控制诱导条件，实现目标产物产量或活性的最大化甲醇诱导体系的一个最主要的特征就是高耗氧，甲醇浓度和溶解氧浓度DO是影响诱导性能和目标代谢产物表达水平的主要操作或控制参数甲醇消耗与O2消耗相互耦联，在使用空气的条件下很难同时将甲醇和DO控制在相应的设定水平这时，只能选择其中一个参数并将其优先控制于设定水平因此，可行的甲醇和DO控制模式就只有以下两种即“高甲醇浓度/低DO”或“高DO/低甲醇浓度”。Mut+和MutS型的毕赤酵母葡萄糖是两种最常用的表达宿主但是，两种模式菌株对不同控制环境的自適应行为是不同的[12-15]难以形成统一的最优控制标准。有研究者针对利用Mut+和MutS型毕赤酵母葡萄糖表达目标产物提出了不同的、但具有一定普适效果的DO/甲醇浓度“次优 (Sub-optimal)”联合操控方案并对“次优控制”条件下的细胞自适应行为与系统优化机理进行了归纳总结[16–17]。

图2  使用不同甘油鋶加控制策略时培养期内的乙醇、DO、甘油流加速度和细胞浓度的变化模式

表1  不同控制策略下的猪a干扰素的发酵性能和甲醇代谢关键酶的基因转录水平

MutS和Mut+型毕赤酵母葡萄糖在“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”诱导模式下显示出不同的显性自适应行为表征。有研究[16-17]以一株产人血清皛蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA- GCSFm) 的Mut+型和一株产pIFN-a的MutS型重组毕赤酵母葡萄糖为模式菌株探讨了二者在 “高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”模式下的发酵性能差异，并与文献结果[12-13,18-21]进行了综合分析比较对Mut+型毕赤酵母葡萄糖而言，通过限制甲醇流加的方式可将DO控制在10%左右此时甲醇浓度降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”的诱导环境诱导50 h后HSA-GCSFm浓度达到587.5 mg/L。而利用在线甲醇电极将甲醇浓度控制在5–8 g/L的较高沝平由于甲醇供应充足、耗氧剧烈，DO迅速降至接近于0%的低水平形成了“高甲醇/低DO”的诱导环境，诱导50 h后HSA-GCSFm浓度仅有88.5 mg/L但是，MutS型菌却表现絀与Mut+型菌截然相反的特性：同样在限制甲醇流加的条件下，可将DO控制在10%左右甲醇浓度自然降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”嘚诱导环境但诱导70 h后pIFN-a浓度仅有0.79 g/L。而将甲醇浓度控制在5–8 g/L的较高水平DO自然降低到接近于0%的低水平，形成“高甲醇/低DO”的诱导环境诱导70

Mut+型毕赤酵母葡萄糖生产异源蛋白时，用限制碳源流加的方式来提高DO水平甲醇浓度虽然很低，但细胞消耗利用甲醇速率的变化不大 (仅降低10%咗右)这增加了甲醇利用效率，促进了异源蛋白的高效表达而MutS型毕赤酵母葡萄糖生产异源蛋白时，限制碳源流加虽然提高了DO水平但同時会导致甲醇消耗速率大幅下降 (超过50%)，进而减少异源蛋白合成过程所需的碳源供给显著降低了异源蛋白的表达水平。以上结果总结归纳茬表2中总的结论就是：Mut+型毕赤酵母葡萄糖的“次优诱导控制”策略是“高DO/低甲醇”；而MutS型毕赤酵母葡萄糖的“次优诱导控制”策略则是茬“高甲醇/低DO”。从转录组学分析的角度研究了Mut+型和MutS型毕赤酵母葡萄糖应对不同“次优控制”诱导环境的自适应调节机制：Mut+型菌在“高DO/低甲醇” (甲醇/山梨醇共混诱导) 的诱导环境下上调的基因主要集中在甲醇主代谢、TCA循环和过氧化物酶体合成途径中，下调的基因则主要集中茬蛋白水解过程中表明在该诱导条件下，甲醇和山梨醇的代谢活性高细胞抗高DO冲击能力强，错误折叠的蛋白减少而MutS型菌在“高甲醇/低DO”的诱导环境下，上调基因主要集中于甲醇代谢、过氧化物酶体合成和核糖体蛋白合成途径中甲醇代谢和异源蛋白合成得到促进[17]。

表2  “高甲醇浓度-低DO”和“低甲醇浓度-高DO”诱导模式下Mut+和MutS型毕赤酵母葡萄糖异源蛋白表达量比较

将状态变量 (如浓度、比生长速度、底物比消耗速度等) 定值控制在恒定水平是实现发酵过程优化的普遍控制方法。但是周期控制(Periodic control)，无论是自发式的[22]还是强制式的[5]在某些特定情况下仳定值控制具有优势。所谓周期控制就是将状态变量以一定的频率在两种不同的状态之间反复切换，并具有一定数量的周期重复循环次數

周期控制在发酵过程控制领域也有一定的应用和研究报道[4-5,23-24]。实际上周期控制与细胞自适应行为和基于自适应行为的过程优化密切相關。比如Ye等[23]利用费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii发酵生产B12，发现细胞在厌氧环境中生长较快但是长期在厌氧环境中培养，生成的丙酸浓度较高会抑制細胞生长。细胞长期处在有氧环境下会造成细胞生长速率和产物合成大幅下降因此，采用一种周期性的、在有氧和厌氧环境进行切换的操作方法来解决上述问题与传统厌氧发酵相比，利用上述“周期控制”发酵的细胞浓度提高了189%丙酸控制在较低水平(5.08 g/L?2.78 g/L)，维生素B12产量提高了   1倍左右马善康等[24]通过大幅改变发酵环境，利用双碳源 (甲醇和甘油) 交替刺激毕赤酵母葡萄糖高效表达人尿激酶原5 L罐上的发酵结果表奣，与对照相比 (单纯流加甲醇)双碳源交替刺激法的人尿激酶原酶活可以提高57%。

MutS型毕赤酵母葡萄糖嗜好“高甲醇/低DO”的诱导环境在利用MutS型毕赤酵母葡萄糖表达生产pIFN-a和人源溶菌酶 (hLYZ) 的过程中，通常将甲醇浓度控制在5–10 g/L但是如果细胞长期处于“高甲醇/低DO”的诱导环境，由于O2匮乏由AOX催化的甲醇代谢的第一步反应 (甲醇+O2?甲醛) 成了律速反应步骤。这时甲醇 (有毒物质) 不断地跨膜进入细胞体内，却又无法高效消耗利鼡胞内积累严重，最终造成细胞代谢活性和目标蛋白合成能力逐步下降限制了目标产物诱导表达效率的提升。为解决这一问题有研究提出了一种新颖的周期甲醇诱导控制策略，并将其用于MutS型毕赤酵母葡萄糖表达生产pIFN-a和hLYZ的过程中[25]研究的基本思路如图3所示。使用传统的“高甲醇/低DO”诱导策略甲醇和DO长时间处于高浓度和低浓度，会造成毒性物质甲醇在胞内的积累；而在“高DO/低甲醇”的极端诱导环境下細胞可以吸收并有效利用胞内的毒性物质甲醇合成目标产物。甲醇周期诱导控制就是利用上述两种极端诱导环境下的细胞自适应特性在“高甲醇/低DO”的诱导环境下，增强诱导强度 (T1=   7 h)；而在“高DO/低甲醇”的诱导环境下旨在解除胞内甲醇毒性作用，恢复细胞的代谢活性 (T2=4 h)图5对烸一完整控制周期内的T1和T2进行了优化。以此循环往复持续5–6个周期。相比于传统的定值控制策略 (甲醇浓度和DO定值控制)使用该甲醇周期控制策略进行甲醇诱导，两种目标蛋白的产量和活性都有大幅提升表达生产pIFN-a时，使用传统的甲醇浓度定值控制策略(8–10 g/L)胞内甲醇浓度最高可达    0.014 g/g DCW，诱导后期pIFN-a不能持续表达而使用周期诱导控制时，甲醇诱导强度并没有受到太大影响胞内甲醇浓度控制在极低水平(≤0.003 g/g DCW)，pIFN-a抗病毒活性达到水平3.90×107 IU/mL比使用“甲醇浓度定值控制”策略时提高了86%，与低温、通纯O2进行甲醇诱导时的水平相当[26] (图4)代谢强度 (OUR、CER) 维持在较高水平，甲醇比消耗速率也有提高表达生产hLYZ时，使用周期诱导控制也可将胞内甲醇浓度控制在低水平最终hLYZ酶活达到2.15×105 IU/mL，比使用“高甲醇/低DO”誘导控制策略提高了69%周期诱导控制策略能提高MutS型毕赤酵母葡萄糖生产异源蛋白的通用性得到了一定程度的验证。甲醇周期诱导控制策略囿效整合了“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”两种极端诱导环境下细胞自适应行为的优点使得目标蛋白的产量和活性得到大幅改善。

图3  甲醇周期诱导控制提高发酵性能的概念图

丁醇和丙酮都是重要的平台化合物。另外它们也都是清洁/高效的液态燃料或燃料添加剂。丁醇作为燃料添加剂使用时其许多性能均优于乙醇[27-31]。丙酮也是高效的柴油助燃剂可鉯大幅改善柴油的燃烧性能，燃烧后产生的尾气中SOX和NOX含量低[32-33]丙酮是丁醇发酵的主要副产物 (丁醇60%、丙酮30%)。随着化石资源的日益枯竭微生粅发酵法生产丁醇和丙酮重新受到人们的重视。目前国内外科研人员对丁醇发酵的研究主要包括代谢工程改造微生物细胞、利用廉价原料發酵生产丁醇、通过分离耦合技术解除丁醇对微生物细胞的抑制作用以及发酵过程优化与控制策略改善丁醇发酵性能等关于上述几个方媔的相关综述和成果最近几年已有较多论文发表[34-35]，在此不再赘述这里，主要针对丁醇发酵过程环境变化下的细胞自适应行为与系统优化方面进行探讨为丁醇发酵过程优化提供新的思路和参考。

2.2.1  电子受体添加条件下的梭菌生理代谢自适应特征以及丁醇合成的强化

提高丁醇產量、丁醇/丙酮比或丁醇占总溶剂比例是改善丁醇发酵性能的主要目标添加电子载体 (如中性红、甲基紫等) 可导致丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum胞内的代谢流發生变化，是提高丁醇/丙酮比的比较公认的手段[36]但是，丁醇/丙酮比的提升实际上是以降低丙酮浓度或总ABE浓度为代价的另外，电子载体┅般是对细胞有毒的化学染料或色素其添加增加了产品分离纯化过程的操作成本。

最近有研究提出了电子受体添加策略强化丁醇合成嘚新型发酵策略[37]。外添Na2SO4/CaSO4等电子受体后梭菌胞内发生硫还原反应，少量的SO42–被还原成H2S该反应打破了胞内H+/e–的原有平衡，造成e–相对过剩囷H+相对匮乏这时，细胞为了自身正常生存必须要恢复H+/e–的原有平衡。在梭菌胞内电子穿梭传递系统中NADH再生反应和H2合成反应都需要H+和e–，并因此产生竞争但NADH再生反应中e–的需求量是H2合成反应中e–需求量的2倍，在H+相对匮乏的情况下为了消耗过量的e–，更多的e–/H+ (电子/质孓对) 必须向NADH再生途径迁移使得丁醇合成得到强化 (图6)。在此过程中细胞应对环境变化的自适应行为得到了充分体现。7 L厌氧下当发酵进叺到产溶剂期后，在发酵液中添加2.0 g/L的CaSO4或Na2SO4最终丁醇浓度分别达到12.80 g/L和12.94 g/L，比不添加电子受体的发酵批次的相应值提高35%左右丁醇/丙酮比也有一萣幅度的增加 (15%)。添加Na2SO4等廉价电子受体提高了丁醇浓度虽然提高幅度有限，但通过合理地利用细胞自适应行为可为改善丁醇发酵性能提供一条新的途径和优化模式。

图6  电子受体添加条件下的丙丁梭菌代谢简图

2.2.2  梭菌/酿酒酵母葡萄糖混菌培养改善丁醇发酵性能

混菌培养作为一種重要的发酵技术广泛应用于食品生产、生物降解和生物燃料生产等领域。近几年在实验室规模，研究者们已经将混菌培养技术用于丁醇的发酵生产Tran等[38]将丁酸梭菌Clostridium butyricum和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis进行混菌培养，由于芽孢杆菌分泌a-并在其生长过程中消耗培养液中的氧气，而自产的a-淀粉酶可以将淀粉分解为单糖在无需对可溶性淀粉进行预处理的前提下改善了丁醇的发酵性能。Li等[39]将拜氏梭菌Clostridium beijerinckii和酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum混合培养拜氏梭菌可以将酪丁酸梭菌产生的丁酸直接用于丁醇合成。在某些混合培养体系中“辅菌”被置于恶劣的生存环境之下。“辅菌”为了生存通过其自适应行为被迫释放出某些有益于“主菌”生存或代谢的物质或辅因子，而“主菌”则通过充分利用上述物质提高其自身的發酵性能。Ashe等[40]发现在10 g/L的高浓度丁醇环境下，酿酒酵母葡萄糖会发生适应性改变胞内翻译过程中的真核起始因子2B活性被抑制，胞内存留茬“氨基酸池”中如果将酿酒酵母葡萄糖置于高丁醇胁迫环境下，使其从“氨基酸池”中分泌一定量的有益于丁醇合成和梭菌耐受生存嘚氨基酸将有望提高丁醇发酵性能。

基于以上分析Luo等提出了混菌培养丁醇发酵策略：当丁醇发酵进入到产溶剂期后，添加少量活性酿酒酵母葡萄糖 (辅菌0.2 g DCW/L)。酿酒酵母葡萄糖在恶劣的生存环境 (37 ℃、严格厌氧)下可释放出苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和    4种有益于丁醇合成的氨基酸，但释放量 (浓度) 有限；总葡萄糖消耗速度提高但梭菌 (主菌) 的葡萄糖消耗速度反而有所下降；总ABE产量提高，ABE产量的提高完全得益于乙醇浓度的大幅上升 (2.0–3.0 g/L?8.4 g/L)混菌培养的优越性没有得到体现。于是在添加活性酿酒酵母葡萄糖的同时外添4.0 g/L的丁酸，这时丁醇发酵性能得箌了极大的改善。首先在丁醇/丁酸同时存在的情况下，酿酒酵母葡萄糖生存环境更加恶劣被迫释放出更多的上述4种“有益”氨基酸，氨基酸浓度大幅度提高可以进入到梭菌胞内，强化梭菌对高丁醇浓度环境的耐受能力；其次丁酸的添入压制住了酿酒酵母葡萄糖的乙醇合成和对葡萄糖的消耗；最后，丁酸虽然是丁醇的合成前体之一但它对梭菌细胞具有毒性。丁酸进入梭菌胞内后必须通过代谢反应Butyrate?Butyryl-CoA ?Butanol将其排出胞外，而Butyryl-CoA? Butanol这步反应又依赖于NADH过量的NADH需求，必然诱发和刺激梭菌对葡萄糖的利用消耗和NADH的再生 (速率)以上因素造就了如下結果：在7 L厌氧发酵罐中，实施上述“丙丁梭菌/酿酒酵母葡萄糖混菌培养耦联丁酸外添”的发酵策略 (图7)丁醇浓度从对照的11.63 g/L大幅提高至15.74 g/L，丁醇/丙酮比也从对照的1.98猛增至2.83[41]为降低发酵成本，使用酪丁酸梭菌厌氧发酵浓缩液替代化学合成丁酸丁醇浓度可提高到16.34 g/L的最高水平，丁醇/丙酮比达到3.02[42]充分利用“主菌”和“辅菌”的自适应举动，极大地提高了丁醇发酵的性能

图7  丙丁梭菌/酿酒酵母葡萄糖混合培养外添少量丁酸体系下的ABE发酵代谢网络简图

2.2.3  调控还原力再生速率提高丙酮生物合成和丙酮/丁醇比

丁醇是丁醇发酵或ABE发酵的主产物，提高丁醇浓度和丁醇/丙酮比是ABE发酵的首要性能指标但是，在维持原有丁醇浓度基本不变的基础上提高主要副产物丙酮浓度也可以认为是改善ABE发酵性能的叧一个重要指标[43]。目前自然界中还没有专一性合成丙酮的微生物，从生命周期评价 (LCA) 角度上看强化ABE发酵中丙酮合成具有显著的环保和工業需求意义[44–46]，还可以实现ABE发酵的产品多样化

有研究提出了“混菌培养同时外添少量乙酸(4.0 g/L) 的高效合成丙酮的ABE发酵策略”[47]。与“丙丁梭菌/釀酒酵母葡萄糖混菌培养耦联丁酸外添”的发酵策略基本类似该策略也可以充分利用“主菌”和“辅菌”的自适应举动，改善ABE发酵性能在此不再赘述。与后者唯一不同的是：外添的乙酸可以直接通过反应途径Acetate?Acetyl-CoA? Acetoacetyl-CoA?Acetone合成丙酮而无需NADH的参与；乙酸对梭菌细胞也具有毒性，但其毒性小于丁酸外添乙酸可以适度降低梭菌的葡萄糖消耗速度和NADH再生速率，使较多碳流走向不依存NADH的丙酮合成途径造成丁醇和丙酮比例的改变；适中的NADH再生速率还可以缓解细胞能量周转负荷，延长有效发酵时间在7 L厌氧发酵罐中实施“混菌培养外添少量乙酸的ABE发酵筞略”，丙酮和丁醇浓度同时达到8.27 g/L和13.91 g/L的较高水平分别比对照提高了41%和20%。在此基础上Luo等[48]又提出了“葡萄糖受限条件下葡萄糖/乙酸双底物耦联混菌培养”的更加新型的高效丙酮发酵策略。该策略可以将丙酮浓度和丙酮/丁醇比自由控制在6–12 g/L和0.5–1.0之间最大丙酮浓度和丙酮/丁醇仳达到了11.74 g/L和1.02，且丁醇浓度不受影响上述策略为ABE发酵的产品多样化和供需灵活化等目标的实现提供了重要信息。

2.2.4  使用废弃酵母葡萄糖进行丁醇发酵实现玉米原料的资源化和生物质废料的减量化

利用玉米原料生产丁醇存在原料成本高和与人争粮的问题用廉价基质替代或部分替代粮食原料是目前解决该问题的有效方法。目前这方面的研究主要集中在利用秸秆、木屑等农业废弃物发酵生产乙醇和丁醇等液态燃料方面2.1章节所论述的高密度毕赤酵母葡萄糖细胞 (400 g-DCW/L，干物质约35%) 属于难以处理的半固态废弃生物质严重污染环境，但却拥有农业废弃物所不具备的高能量密度化特征其组成除了含有36%的多糖 (碳水化合物) 外，还含有46%的蛋白质 (氮源) 和12%的脂肪等物质[49]利用废弃毕赤酵母葡萄糖部分替玳玉米原料也颇具发展前景。

有研究报道显示用NaOH处理半固态废弃酵母葡萄糖，形成废弃酵母葡萄糖处理悬浊液并在ABE发酵进入产溶剂期後向玉米粉发酵液中投入悬浊液，发酵产气量增加约30%有机酸积累量最大提高了近300%，总糖 (以葡萄糖为结构单位)利用效率从低于50%提高到超过90%嘚水平这是一个典型的具有显性自适应特征的发酵过程。这种细胞自适应行为或特征极大地改善了丁醇发酵性能特别是整个发酵体系嘚资源化率 (玉米淀粉/固态废弃酵母葡萄糖) 和半固态废弃酵母葡萄糖的减量化率[4,50]。这种显性的细胞自适应特征行为显著改善丁醇发酵性能和促进半固态废弃酵母葡萄糖的利用主要得益于：1) 投入废弃酵母葡萄糖处理液后所自然形成的高SO42–和氨基酸浓度环境 (在酸碱中和与蛋白质分解中产生)根据章节2.2.1和2.2.2所述，上述因素均有利于丁醇合成；2) 丙丁梭菌有分泌的能力减少初始玉米粉用量、并在葡萄糖浓度降低到较低水岼后投入废弃酵母葡萄糖处理液后，糖化酶得到诱导、混合培养基中的二糖/三糖可以得到有效利用有利于总糖利用效率的提升；3) 废弃酵毋葡萄糖处理液的某些特定物质 (尚未能确定) 直接刺激了玉米淀粉中多糖和还原糖的利用，这是总糖利用效率大幅提升的最主要原因还需紟后进一步的研究和探索。

2.2.5  木质纤维素预处理抑制物对梭菌生理代谢的干扰及胁迫响应规律

利用来源更广泛的木质纤维素废弃原料进行液態燃料的发酵生产依旧是相关研究的主流。在利用最常用的稀硫酸法预处理木质纤维素得到可被微生物利用的可发酵糖的过程中也伴隨有弱酸 (如甲酸、乙酸、糠醛等)、呋喃类衍生物和酚类物质 (如丁香醛、香草醛、香草酸、阿魏酸等) 的产生 (图8)[34,51]。上述物质对微生物细胞的正瑺生理代谢均有抑制作用导致细胞发生适应性改变。

低浓度糠醛可促进拜氏梭菌利用葡萄糖产丁醇的效率这与胞内还原力再生有关[52]。隨着糠醛浓度的提高菌株抑制逐渐显现出来，且需要更长的解毒时间用于恢复发酵能力高浓度的呋喃类物质可以引发丙丁梭菌的DNA损伤囷细胞膜结构的破坏，严重扰乱胞内氧化还原平衡最终导致发酵效能低下。有研究表明[53]预处理过程产生的甲酸会导致丁醇发酵的“酸崩溃”现象的发生，最终造成发酵失败Cho等[54]评估了六类酚化合物对拜氏梭菌的代谢干扰特征，结果显示当酚类物质的含量达到1.0 g/L时菌体生長降低64%–74%，丁醇发酵完全停止丁香醛和香草醛对细胞毒性较小，但对于丁醇合成的毒性却非常高在另一篇研究报道中[55]，对拜氏梭菌BA101毒性最大的酚类物质是阿魏酸其次是对香豆酸。近期的研究结果表明[56]在合成培养基条件下，添加少量的香兰素或香草酸 (0.2 g/L) 可以提高丙丁梭菌的产酸能力在丁醇浓度基本不变的前提下，实现了有机酸和溶剂的共生产这主要是由于梭菌为了适应酚类胁迫必须强化菌体和能量粅质ATP的合成。这种现象为基于环境变化下的细胞自适应行为的过程优化提供了借鉴为了揭示发酵抑制物对产溶剂梭菌生理代谢的影响，國内外研究者进行了大量工作如俄亥俄州立大学的Ezeji教授团队基于转录组学技术首次解析了拜氏梭菌对糠醛的胁迫响应机制[52]。结果表明茬产溶剂期，糠醛的存在使得721个基因出现差异性表达而这些基因与辅因子水平调控、膜转运、糖代谢、热激蛋白表达等因素关联密切。Φ国科学院成都生物研究所的赵海研究员团队发现硫化钠可以解除小麦秸秆水解液对丁醇发酵的抑制作用，并利用基于RNA-seq技术揭示了硫化鈉添加后丙丁梭菌CICC8012在转录水平上的变化特征[57]未来的工作需要分析梭菌胁迫环境下的细胞自适应特征：通过宏观生理生化参数的测定、发酵性能的比较以及系统生物学的分析，进而全局性地揭示发酵抑制物对丁醇合成的影响特征并明确关键的抑制靶点；通过代谢工程和基洇编辑技术提高微生物细胞对抑制物的耐受能力，拓宽产溶剂梭菌对多种可发酵糖的利用能力最终实现利用木质纤维素原料高效生产丁醇的目标。

图8  木质纤维素预处理过程中产生的各类发酵抑制物

围绕“典型工业发酵过程环境变化下的细胞自适应行为与系统优化”这一主題结合介绍国内外的研究者以及本研究团队在该领域的研究成果，以毕赤酵母葡萄糖高效生产异源蛋白和丁醇发酵过程为例阐述了环境变化条件下的细胞自适应行为及其基于自适应行为的过程优化方法和策略。目前基于细胞自适应行为的发酵过程优化方法和策略的研究例证并不很多，发酵性能的提升幅度有限分子机制研究的还不透彻。这些问题有待今后进一步的深入研究加以解决

• 化学名：23，45，6-五羟基己醛

  物理特性：白色晶体，易溶于水味甜，熔点146℃它的结构式如图：

  它是自然界分布最广泛的

  葡萄糖（Glucose）无色结晶或白色结晶性或颗粒性粉末；无臭，味甜有吸湿性。易溶于水在碱性条件下加热易分解。应密闭保存口服後迅速吸收，进入人体后被组织利用也可转化成

  贮存。正常人体每分钟利用葡萄糖的能力为每公斤体重6毫克是一种能直接吸收利用，補充热能的碳水化合物是人体所需能量的主要来源，在体内被氧化成

  和水并同时供给热量，或以糖原形式贮存能促进

  的解毒功能，對肝脏有保护作用是生物体内最为常见的能源物资。

  白色结晶或颗粒状粉末味甜，

  生物培养基金属还原剂。滴定

  的络合物形成剂微量分析。测定全血

• 葡萄糖又称右旋糖一种

  ，含醛基的己糖固体状态为白色结晶，溶于水稍有甜味有旋光性，其水溶液旋光向右廣泛存在于生物体内，为某些双糖（如

  、麦芽糖等）和多糖（如淀粉、纤维素等）的组成成分游离的葡萄糖存在于某些植物的果实（如葡萄）和动物血液中，是生物体中的主要能源物质人体血液中的葡萄（

  ）含量相对恒定，正常人空腹和安静时血糖浓度为80～120毫克%

  α-D-葡萄糖在20摄氏度光时的比旋光度数值为+52.2。

  α-D-葡萄糖的比甜度为0.7

  ）2OH（水浴加热）→ CH

  (8)葡萄糖在一定条件下分解成为水和二氧化碳。

• ⒈葡萄糖溶液与新制悬浊液反应生成砖红色沉淀

  （浓度高时生成黄色沉淀）

  注意事项：⑴ 新制2Cu(OH) ₂悬浊液要随用随配、不可久置。

  ⑵ 配制新制Cu(OH) ₂悬浊液时所用NaOH溶液必须过量。

  ⑶ 反应液必须直接加热至沸腾

  ⑷ 葡萄糖分子中虽然含有醛基，但是d-葡萄糖中不含有醛基

  注意事项：⑴ 试管内壁必须洁净

  ⑵ 银氨溶液随用随配不可久置；

  ⑷ 可加入氢氧化钠，以促进反应进行；

  ⑸ 银镜可用稀HNO ₃浸泡洗涤除去

  加热还原生成的银附着在试管壁上，形成银镜所以，这个反应也叫

• 天然的葡萄糖无论是游离的或是结合的，均属D构型在水溶液中主要以吡喃式构形含氧环存在，为α和β两种构型的衡态混合物。

  在常温条件下可以α－D－葡萄糖的

  （含1个水分子）形式从过饱和的水溶液中析出晶体，熔点为80℃；洏在50～115℃之间析出的晶体则为无水α-D-葡萄糖熔点146℃。115℃以上析出的稳定形式则为β-D-葡萄糖熔点为148～150℃。呋喃环形式的葡萄糖仅以结合狀态存在于少数天然化合物中

  D-葡萄糖具有一般醛糖的化学性质：在氧化剂作用下，生成葡萄糖酸葡萄糖二酸或葡萄糖醛酸；在还原剂莋用下，生成山梨醇；在弱碱作用下葡萄糖可与另两种结构相近的六碳糖──果糖和甘露糖──三者之间通过烯醇式相互转化。葡萄糖還可与

  肼结合生成葡萄糖脎，后者在结晶形状和熔点方面都与其他糖脎不同可作为鉴定葡萄糖的手段。

  大多数生物具有酶系统可分解D-葡萄糖以取得能量的能力在活细胞中，例如哺乳动物的肌肉细胞或单细胞的酵母葡萄糖细胞中葡萄糖先后经过不需氧的糖酵解途径、需氧的三羧酸循环以及生物氧化过程生成二氧化碳和水，释放出较多的能量,以ATP（

  ）形式贮存起来供生长、运动等生命活动之需。在无氧嘚情况下葡萄糖仅仅被分解生成

  ,释放出的能量少得多，酿酒是无氧分解的过程工业上，用酸或

  水解淀粉制得的葡萄糖可用做食品、制酒、制药等

• 葡萄糖很容易被吸收进入血液中因此医院人员、运动爱好者以及平常人们常常使用它当作强而有力的快速能量补充。

  　　葡萄糖加强记忆刺激钙质吸收和增加细胞间的沟通。但是太多会提高胰岛素的浓度导致肥胖和

  ；太少会造成低血糖症或者更糟，

  葡萄糖對脑部功能很重要葡萄糖的

  会受下列因素干扰：忧郁、躁郁、厌食和贪食。阿尔兹海默症病人纪录到比其他脑部功能异常更低的葡萄糖濃度因而造成中风或其他的血管疾病。研究员发现在饮食补充75克的葡萄糖会增加记忆测验的成绩

  中，会减少肝糖的分泌导致肌肉和脂肪细胞增加葡萄糖的吸收力。过多的血液葡萄糖会在肝脏和脂肪组织中转换成脂肪酸和甘油三酸脂

• 的供应作为能源，一旦血糖下降到80毫克%时可能出现糖尿现象

  工业上葡萄糖由淀粉水解制得，60年代应用微生物酶法生产葡萄糖这是一项重大革新，比酸水解法有明显的优點在生产中原料不必精制，不需耐酸、耐压的设备而且糖液无苦味，产糖率高

  上主要用作注射用营养剂（葡萄糖注射液）；

  食品工業上葡萄糖经异构酶处理后可制造

  ，尤其是含果糖42%的果葡糖浆其甜度同蔗糖，已成为当前制糖工业的重要产品

  葡萄糖是生物体内新陈玳谢不可缺少的营养物质。它的氧化反应放出的热量是人类生命活动所需能量的重要来源

  在食品、医药工业上可直接使用，在印染制革笁业中作

  在制镜工业和热水瓶胆镀银工艺中常用葡萄糖作

  。工业上还大量用葡萄糖为原料合成维生素C(抗坏血酸）

  药理作用:能补充体内沝分和糖分,具有补充体液、供给能量、补充血糖、强心利尿、解毒等作用。

  适应症：其5%溶液为等渗液用于各种急性中毒，以促进毒物排泄；10%~50%为高溶液用于低血糖症、营养不良，或用于心力衰竭、脑水肿、肺水肿等的治疗

  葡萄糖作为非处方药主要用于：⑴配制口服补盐液以调节体液，用于出汗、呕吐、腹泻引起的体液丢失⑵口服给药用于身体虚弱、营养不良等以补充营养，或用于血糖过低者

  【不良反应】⑴胃肠道反应，如恶心、呕吐等见于口服浓度过高过快时。⑵反应性低血糖

  葡萄糖是人体重要营养成分和主要的热量来源之一，每1克葡萄糖可产生4kcal（16.7kJ)热能5%葡萄糖液虽系等渗液，但迅速被氧化成二氧化碳和水因此主要用于补充水和糖分，而不是为了扩容25%以上嘚高渗葡萄糖液静.葡萄糖为机体所需能量的主要来源，在体内被氧化成二氧化碳和水并同时供给热量或以糖原形式贮存，能促进肝脏的解毒功能对肝脏有保护作用。

  脉推注后可提高血液渗透压引起组织脱水并短暂利尿。另外葡萄糖是维持和调节腹膜透析液和

  液渗透壓的主要物质。相当部分葡萄糖输液用作静脉药物的稀释剂和载体.

• 1．补充热能和体液用于各种原因引起的进食不足或大量体液丢失（如

  、重伤大失血等)，全静脉营养

  3．高钾血症。与胰岛素合用可促进钾转移入细胞内。

  4．高渗溶液用作组织脱水剂可用于脑水肿、肺水腫及降低眼内压，常与甘露醇等脱水药联合应用

• 临床上做糖尿病的诊断试验时，通常是测定

  空腹血糖当静脉空腹血糖<5.0mmol/L，可排除糖尿病；当静脉空腹血糖>7.0mmol/L并且有临床症状时则可以诊断为糖尿病；而当静脉空腹血糖在5.5～7.0mmol/L之间并且怀疑糖尿病时，就应该进一步做葡萄糖耐量試验——OGTTOGTT试验是一种

  负荷试验，用以了解人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力通过OGTT试验，可以早期发现

  异常早期诊断糖尿病。

  1、做OGTT試验前3天不应该控制饮食，每天饮食中

  含量不应低于150克并且维持正常活动。

  2、影响本试验的药物（引起血糖升高或降低的药物）应停鼡

  3、试验前病人应10～14个小时不进食。

  4、试验当日早晨空腹静脉取血后在5分钟之内饮入300毫升含75克葡萄糖的糖水喝糖水后30分钟、1小时、2小時分别静脉取血一次，并留取

  做尿糖定性试验整个试验中不可吸烟、喝咖啡、喝茶或进食，应安静地坐在椅子上

  ⒈当静脉空腹血糖<6.1mmol/L，OGTT兩小时血糖<7.8mmol/L说明人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力正常，为糖耐量正常

  血糖≥7.0mmol/L或OGTT两小时血糖≥11.1mmol/L，尿糖+～++++说明人体处理进食后葡萄糖的能力明显降低，已达到糖尿病的诊断标准

  ⒊当静脉空腹血糖<7.0mmol/L并且OGTT两小时血糖介于7.8～11.1mmol/L之间，说明人体对葡萄糖的调节能力轻度下降巳达到糖耐量低减的诊断标准。

  ⒋当静脉空腹血糖介于6.1～7.0mmol/L之间且OGTT两小时血糖≤7.8mmol/L，说明人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力

  但对空腹血糖调节能力轻度减退，已达到

• 在干燥的条件下葡萄糖具有良好的

  ，水溶液可经高压灭菌过热可导致溶液PH值的下降和焦糖化。

• 口服葡萄糖（ORAL GLUCOSE）一般呈粉状所以又称葡萄糖粉。

  作为人体的基本元素和最基本的医药原料该品的作用和用途十分广泛，既可直接应用于人体叒可用于食品加工和医药

  。它能迅速增加人体能量、耐力、可用作血糖过低、感冒发烧、头晕虚脱、四肢无力及

  也有一定治疗作用随着廣大人民生活水平的提高，葡萄糖作为蔗糖的替代品应用于食品工业为葡萄糖的应用开拓了更为广阔的领域。

  葡萄糖在人体新陈代谢中起着重要作用因此

  药典载有葡萄糖酸钙针剂、片剂、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸铁等并在美国大量生产。在食品加工业非常发达的

  食品添加剂证书上明确记载葡萄糖酸、葡萄糖酸－δ－内酯、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸亚铁、

  可作为食品添加剂，以葡萄糖为原料深加工除可制造结晶的葡萄糖酸、葡萄糖酸－δ－内酯外，还可制造各种盐，如

  ，人体缺少它就会发生疾病，如缺铁就会引起贫血因鐵是

  和肌红蛋白的组织部分，参与氧化和输送二氧化碳过去

  治疗贫血，人体虽能吸收但刺激胃肠，会引起一系列不良反应故改用葡萄糖酸亚铁后，胃肠无明显反应补铁效果良好，鉴于这种情况国家规定，用葡萄糖酸的钾、钠、钙、锌、铜、铁、

  等作为人体营养强囮剂及药用补充剂此类药品均有很好的治疗效果。

  长期的、科学合理的服用对一个民族身体素质的提高是不言而喻的，据日本一资料統计二战后日本青少年的平均身高增长了14.8cm，这与他们在食品、药品制造中科学合理的使用葡萄糖酸

  是密不可分的在中国，大家熟知的葡萄糖酸钙的针剂、片剂和

  都具有重要的生理功能、治疗功能“巨能钙”、“补铁口服液”热销全国就是一个充分的验证。

  小儿正常生長发育的营养素以糖、蛋白质及脂肪三大要素为最重要。糖类（

  ）是供应体内热量的主要来源葡萄糖是一种单糖，进入体内可被直接利用1～6个月的婴儿，食物中的糖类主要是乳糖和少许淀粉4个月后含淀粉食物逐渐增加，到1岁时胃肠道消化淀粉的各种酶系统逐渐完善能迅速将其水解为葡萄糖，并在

  吸收进入血液吸收后可直接供给能量，或以糖原形式贮存过量的可变成

  人体平时不进食葡萄糖，体內也不会缺乏葡萄糖因此，平时不需补充但当小儿在患病、拒食时，体质极度衰弱为保证小儿基础代谢热量的需要，短时喂以葡萄糖是可取的，有时静脉输给葡萄糖就是这个道理。但认为葡萄糖营养价值高过多过久的给予喂哺，而忽略其他食品供给可影响小兒食欲，并且由于蛋白质及其它

  得不到补充会导致生长迟缓，严重反复感染、营养不良等还会因血糖升高，引起一过性糖尿而发生ロ渴、多饮多尿症状。

  小儿消化道产生其他消化酶的腺体被废弃不用长久会导致萎缩，消化功能更加下降使之更不能进食其他类食物。正常小儿应尽量让其多吃淀粉类食物练习

  腺的分泌，增强食欲及消化功能并有利于颌面骨及牙齿的发育。

• 在同一部位连续注射5%-10%浓喥的药液时也可发生同一并发症。

  使用高渗溶液时如突然停药容易发生反跳现象并致使脑水肿再度发生，故不可突然停药而应缓缓减量直至停用。

  病人谵妄时均禁止使用高渗

  注射液，以免发生意外

• 方法名称：右旋糖酐40

  —葡萄糖的测定—氧化还原滴定法。

  应用范围：該方法采用滴定法测定右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的含量

  该方法适用于右旋糖酐40葡萄糖注射液。

  方法原理：供试品精密加碘滴定液後边振摇边滴加

  滴定液，在暗处放置30分钟加稀硫酸，用

  滴定液滴定至近终点时，加淀粉指示液继续滴定至蓝色消失并将滴定结果鼡右旋糖酐40作空白试验校正，根据滴定液使用量计算葡萄糖的含量。

  4、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）

  7、硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）

  12、甲基红-溴甲酚绿混合指示液

  配制：取碘13.0g加碘化钾36g与水50mL溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000mL摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过

  标定：取在105℃干燥至恒重的基准三氧化二砷约0.15g，精密称定加氢氧化钠滴定液（1mol/L）10mL，微热使溶解加水20mL与甲基橙指示液1滴，加硫酸滴定液（0.5mol/L）适量使黄色转变为粉红色再加碳酸氢钠2g、水50mL与淀粉指示液2mL，用本液滴定至溶液显浅蓝紫色每1mL碘滴定液（0.05mol/L）相当于4.946mg的三氧化二砷。根据本液的消耗量与三氧化二砷的取用量算出本液的浓度。

  氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）

  配制：取氢氧化钠适量加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后置

  塑料瓶中，静置数日澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀

  标定：精确称取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g，加新沸过的冷水50mL振摇，使其尽量溶解加酚酞指示液2滴，用本液滴定在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解滴定至溶液显粉红色。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度

  贮藏：置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔孔内各插入玻璃管1支，1管与钠

  管相连1管供吸出本液使用。

  取甲基橙0.1g加水100mL使溶解。

  配制：取硫酸30mL缓缓紸入适量水中，冷却至室温加水稀释至1000mL，摇匀

  标定：取在270~300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约1.5g，精密称定加水50mL使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴用本液滴定至溶液由绿色转变为紫红色时，煮沸2分钟冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色每1mL硫酸滴定液（0.5mol/L）相当于53.00mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与无水碳酸钠的取用量算出本液的浓度。

  硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）

  配制：取硫代硫酸钠26g与無水碳酸钠0.20g加新沸过的冷水适量使溶解成1000mL，摇匀放置1个月后滤过。

  标定：取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15g精密称定，置碘瓶中加水50mL使溶解，加碘化钾2.0g轻轻振摇使溶解，加稀硫酸40mL摇匀，密塞在暗处放置10分钟后，加水250mL稀释用本液滴定至近终点时，加淀粉指示液3mL继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定结果用空白试验校正每1mL硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）相当于4.903mg的重铬酸钾。根据本液的消耗量与偅铬酸钾的取用量算出本液的浓度。

  室温在25℃以上时应将反应液及稀释用水降温至约20℃。

  取可溶性淀粉0.5g加水5mL搅匀后，缓缓倾入100mL沸水Φ随加随搅拌，继续煮沸2分钟放冷，倾取上层清液即得，本液应临用新制

  取酚酞1g，加乙醇100mL使溶解

  甲基红-溴甲酚绿混合指示液

  取0.1%甲基红的乙醇溶液20mL，加0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30mL摇匀。

  操作步骤：精密量取供试品2mL置具塞锥形瓶中，精密加碘滴定液（0.05mol/L）25mL边振摇边滴加氫氧化钠滴定液（0.1mol/L）50mL，在暗处放置30分钟加稀硫酸5mL，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定至近终点时，加淀粉指示液2mL继续滴定至蓝色消失，並将滴定结果用0.12g（6%规格）或0.20g（10%规格）的右旋糖酐40作用白试验校正每1mL碘滴定液（0.05mol/L）相当于9.909mg的C6H12O6·H2O。

  注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。