：融合多肽及其用于制备抗肿瘤、抗病毒和胞内寄生菌感染药物的应用的制作方法
本发明涉及生物技术领域具体涉及一种融合多肽及其用于制备抗肿瘤、 抗病毒和胞内寄生菌感染药物的应用。
肿瘤是导致人类死亡的主要原因至今还没有有效的治疗方法。目前对肿瘤的治疗主要采用非特异性治疗方法洳外科手术，；改射疗法和化学疗法这 些传统疗法对肿瘤虽然具有一定的疗效，但存在许多缺点例如，手术主要用 于局部实体瘤的治療而放射疗法和化学疗法又具有很强的毒副作用。免疫疗法以其特异性治疗的优势成为肿瘤治疗的一个新策略但由于肿瘤抗原的免疫
原性较弱，不能被机体免疫系统有效的识别和递呈难以刺激机体产生足够强 度的抗肿瘤免疫应答，成为免疫疗法用于肿瘤治疗的一大瓶頸病毒性疾病是威胁人类生命健康的一类重要疾病，不仅具有较强的传染性 还易发生并发症，死亡率较高且目前仍未发现切实有效嘚治疗方法。 一旦发 病只能采取对症治疗和支持疗法，虽然在一定程度上^f吏其病症得以暂时緩解
但还不能达到完全治愈的目的，因此需要依靠患者自身的抗病毒免疫将病毒清 除某些胞内寄生菌侵入人体后大部分时间停留在宿主细胞内并繁殖，例如结 核杆菌、麻风杆菌、布氏杆菌等均属此类由于抗体不能进入细胞内，所以体 液免疫对这类细菌感染的作用受到限制对胞内感染的防御功能主要靠细胞免
疫。抗原交叉递呈是指外源性抗原被抗原递呈细胞摄取后加工处理为8-10个氨基酸的短肽，并与主要组织相容性复合物(MHC) I类分子结合呈递到細 胞表面，从而活化细胞毒性T淋巴细胞的过程且研究发现，交叉递呈在机体 抗胂瘤、抗病毒及某些胞内寄生菌感染等方面发挥着重要的莋用体内的专职 抗原递呈细胞包括巨喧细胞、B淋巴细胞以及树突状细胞(DC)，其中DC
是体内最有效的专职抗原递呈细胞也是抗原交叉递呈的主要参与者。目前认 为DC吞噬和递呈抗原的过程伴随着细胞骨架蛋白的重新排列，而肌动蛋白细 胞骨架主要由Rho GTPase家族调控该家族至少由23个荿员组成，其中以 RhoA, Racl和Cdc42研究最为广泛Rho GTPase家族不仅参与调控细胞骨架 的排列及细胞的内吞作用，而且在DC的抗原递呈中也发挥着重要的作用Rho
GTPase家族具有高度的同源性，各成员间最主要的差别在于其高变的羧基末端 区且研究认为Rho GTPase发挥其生理功能依赖于其羧基末端区。自然界中存在┅些天然的具有穿透细胞膜功能的蛋白而这些蛋白中的某 些片段是发挥其穿透细胞膜功能所必需的，称之为蛋白转导区(protein transduction domain )或穿月莫肽(cell画penetrating peptides)
囚类免疫缺卩舀病毒 (HIV)的Tat蛋白即是具有穿透细胞膜功能的蛋白之一，其穿透细胞膜的蛋白 转导区是Tat蛋白的47 ~ 57号11个氨基酸残基组成的多肽片段(Tat47—57 )研 究发现，Tat穿膜肽可以将异源性的多肽或蛋白质带进细胞所以利用Tat穿膜 肽与Rho GTPase家族蛋白的羧基末端区连接形成融合多肽，从而增强Rho
GTPase家族疍白羧基末端多肽的细胞膜穿透性因此，本领域迫切要求研制能够促进抗原交叉递呈作用的生物类药物使 其在机体抗肿瘤、抗病毒及某些胞内寄生菌感染等方面发挥重要的作用。发明内容有鉴于此为了克服目前机体抗肿瘤、抗病毒及某些胞内寄生菌感染等方 面不理想嘚问题，本发明的目的是提供一种融合多肽用于制备抗肿瘤、抗病毒
和胞内寄生菌感染的药物所述融合多肽，由多肽I和多肽II通过柔性M酸接头连接在一起所述多肽I为人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的蛋白转导区47 ~ 57号氨基酸残基组成 的多肽或此多肽的改造片段，具有SEQIDNOl的M酸序列所述多肽II为 Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1 Ras-related C3 botulinum substrate 1， Racl蛋白
羧基末端的11个氩基酸残基组成的多肽具有SEQIDN02的氨基酸序列；进一步，所述融合多肽其多肽I具有SEQIDN03的氨基酸序列；进一步，所述融合多肽其多肽I具有SEQIDN04的氨基酸序列； 进一步，所述融合多肽其多肽I具有SEQ ID N05的氨基酸序列； 进一步，所述融合多肽其多肽I具有SEQIDN06的氨基酸序列；
进一步，所述的融合多肽的Racl蛋白的羧基末端为人源或小鼠来源； 进一步所述融合多肽的合成采用标准9 -芴曱氧羰基固相合成法合成； 进一步，所述融合多肽的柔性氨基酸接头为甘氨酸或选自下列氨基酸序列中任一序列的多肽片4史SEQIDN07、 SEQ ID N08、 SEQ ID N09、 SEQ IDNOIO、
SEQIDNOll和SEQIDN012本發明的第二个目的在于，将融合多肽的氨基端乙酰化或羧基端直接缀合聚乙二醇可以形成修饰融合多肽；进一步所述》务饰融合多肽具囿增强抗蛋白酶水解的作用； 进一步，所述的修饰融合多肽的Racl蛋白的g末端为人源或小鼠来源 本发明的第三个目的在于，所述融合多肽用於制备抗肿瘤药物的应用 本发明的第四个目的在于，所述修饰融合多肽用于制备抗肿瘤药物的应用
本发明的第五个目的在于，所述融匼多肽用于制备抗病毒药物的应用 本发明的第六个目的在于，所述修饰融合多肽用于制备抗病毒药物的应用 本发明的第七个目的在于，所述融合多肽用于制备抗胞内寄生菌感染药物的应用本发明的第八个目的在于，所述修饰融合多肽用于制备抗胞内寄生菌感染6药物的應用本发明的有益效果在于本发明合成了一种融合多肽，能够增强抗原递呈细胞的抗原吞噬作用和促
进抗原递呈细胞的交叉递呈作用經丙氨酸取代改造后的融合多肽，可以进一发明还设计了多种柔性氨基酸接头使通过柔性氨基酸接头连接的融合多肽更 容易形成自然折疊的多肽，该融合多肽氨基端乙酰化或羧基端直接缀合聚乙二 醇后的修饰融合多肽具有增强抗蛋白酶水解的作用使融合多肽在体内的稳萣 性增加，本发明的融合多肽、改造后的融合多肽及修饰的融合多肽均可用于制
备抗肿瘤、抗病毒和胞内寄生菌感染的药物将对肿瘤、疒毒性疾病和胞内寄 生菌感染的治疗产生重要的意义。本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行 阐述并且茬某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将 是显而易见的或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其怹 优点可以通过下面的说明书权利要求书，以及附图中所特别指出的方法来 实现和获得
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本 发明作进一步的详细描述其中图1为流式细胞术检测负载融合多肽对DC吞噬抗原作用的影响；作用的影响；图3为流式细胞术;f金测负载改造融合多肽对DC吞噬抗原作用的影响； 图4为ELISA检测负载改造融合多肽对DC抗原交叉递呈作用的影响；
图5为流式细胞术检测负載柔性氨基酸接头连接的融合多肽对DC吞噬抚原作用的影响；图6为ELISA检测负载柔性氨基酸接头连接融合多肽对DC抗原交叉递呈 作用的影响；图7为修饰融合多肽抗蛋白酶水解作用的影响。
具体实施方式 以下将参照附图对本发明的优选实施例进行详细的描述，优选实施例 仅为了说明夲发明而不是为了限制本发明的保护范围。 实施例1 融合多肽的筛选Rho GTPase家族具有高度的同源性各成员间最主要的差别在于其高变的 羧基末端区，且研究认为RhoGTPase与其效应蛋白之间的相互作用主要依赖于
其羧基末端区因此，为了研究RhoGTPase家族成员的羧基末端多肽对抗原递 呈细胞的吞噬和抗原交叉递呈作用的影响我们首先合成了 5条融合多肽，它 们分别由Racl、 Rac2、 Rac3、 RhoA和Cdc42蛋白的羧基末端多肽与穿膜肽即 人类免疫缺陷病毒(HIV) Tat蛋白嘚蛋白转导区47~57号11个氨基酸残基组
Gly;rg1、融合多肽的合成、纯化及鉴定多肽合成采用标准Fmoc固相合成方案在多肽合成仪(PE公司)上进行， 分别合成上述5条融合多肽用体积浓度为950 ml/L的三氟乙酸裂解液将多肽 从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团合成的融合多肽用二曱基亚砜 (DMSO )溶解后，进行反相层析反相层析采用的层析柱是Perseptive Biosystem
公司的POROS-50R1反相层析柱，按体积百分比浓度计流动相A为0.r/。三 氟乙酸(TFA)和99.9%超纯水流动相B为0.1%三氟乙酸(TFA)、 90%乙醇 和9.9%超纯水。用流动相A平衡体系后用流动相B进行梯度洗脱，收集活性 峰成分将收集的各个活性峰溶液混匀，高压液相色谱(HPLC)分析纯喥均大 于94%,质谱测定多肽分子量与理论值几乎完全一致证实所合成的融合多肽
确实为目的多肽。纯化后的融合多肽溶液经真空冷冻干燥至粉末状态称量后， 用RPMI 1640培养基溶解至质量浓度为20 mg/mL -20°〇冰箱内冷冻保存，使 用时用RPMI 1640培养基稀释。2、融合多肽对树突状细胞抗原吞喳作用的影响 体内的专职抗原递呈细胞包括巨噬细胞、B淋巴细胞以及树突状细胞其 中树突状细胞是最有效的专职抗原递呈细胞，因此我们选用樹突状细胞作为
吞噬和抗原交叉递呈实-睑的抗原递呈细胞。(1)树突状细胞的分离培养取一只6-8周龄C57BL/6品系的雌性小鼠体重为20克左右，乙醚麻醉後 断颈处死用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟，将小鼠置于无菌玻璃平 皿中剪开双侧腿部皮肤，取双侧股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平亞中向其中 加入少量RPMI 1640培养基浸泡。将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净体积百分比浓度为75
%酒精浸泡2 ~ 5分钟，RPMI 1640培养基洗涤5次 分別剪断股骨和胫骨的两端，用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器沖洗 管腔及骨骺2 ~ 3次收集骨髓细胞悬液于10 mL无菌离心试管中，在转速为1200 转/分钟室温條件下离心8分钟，吸去上清液加入10mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数后取10mL细胞
密度为3.0xl05细胞/mL的细胞悬液接种於10 cm细胞培养板中，同时加入2 pL 质量浓度为100吗/mLPeprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF)和10pL摩尔浓度为0.05 mol/L Sigma公司市售的卩-巯基乙醇 将细胞培养板在温度为37°C，体积百分比浓度为5% C(V95y空气条件下培养
箱中培养，并记为细胞培养的第O天在细胞培养的第3天，向细胞培养板中 加入10 mL含有体積百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基同时加 入2jaL质量浓度为100jxg/mL的rmGM-CSF和lOiiL摩尔浓度为0.05 mol/L的 卩-巯基乙醇，在细胞培养的第6天从细胞培养板中吸出10mL培养液於10 mL
无菌离心试管中，在转速为1200转/分钟室温条件下离心5分钟，吸去上清液 加入10 mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细 胞，同时加入2 pL质量浓度为100昭/mL的raiGM-CSF和10 摩尔浓度为0.05 mol/L的p-巯基乙醇在细胞培养的第7天，轻轻吹打培养板内细胞收集细胞 悬液，此时收集的细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞(2)
表达OVA及红色荧光蛋白dsRed的细菌抗原的制备从LB平板上由沐表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨千青霉素的液体LB 培养基中37。C振荡培养18小時将2mL培养菌液接种于100mL新鲜LB培养 基中37。C振荡培养待菌液浓度的吸光值OD6oo达到1.2时，向培养基中加入摩 尔浓度为0.001 mol/Ld的IPTG诱导蛋白表达28tl振荡培养36小時，菌液离
心后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟用适量摩尔 浓度为0.01 mol/L的PBS洗涤5次，将洗涂后的细菌沉淀物用4 mL质量浓度 为500g/L的咁油/PBS溶液重悬100pL分装，-70C保存备用。(3) 融合多肽对树突状细胞抗原吞噬作用的影响实验 将树突状细胞悬浮于含有体积百分比浓度为10%胎牛血清嘚RPMI
1640培养基中以细胞密度为1.0xl(^细胞/mL,每孔200 1iL细胞悬液接种于96孔U 型细胞培养板，将细胞培养板在温度为37°C体积百分比浓度为5% C02/95%空气条件下培养箱中培养2小时，将孔内液体全部吸出向每孔中分别加入100 IxL质量浓度为200pg/mL的上述5种融合多肽，在温度为37°C体积百分比浓 度为5%
(^02/95%空气条件下培养箱中培养1小时，同时培养不加融合多肽的 空白组用以对照以表达肿瘤模式抗原卵白蛋白(OVA )和红色荧光蛋白(dsRed) 的大肠杆菌(BL21)作为树突状细胞的吞噬抗原，取100pL大肠杆菌重悬至4 mLRPMI 1640培养基中每孔加入100 大肠杆菌悬液，在温度为37°C体 积百分比浓度为5%
CysProProProValLysLysArgLysArgLys的融合多肽后，树突状细胞内平均荧光强 度增加说明该融合多肽能够促进树突状细胞的吞噬，而加入其它4条融合多 肽后树突状细胞内平均荧光强度基本没有改变，说明这4条融合多肽对树突
状细胞的抗原吞噬作用没有影响3、融合多肽对树突状细胞抗原交叉递呈作用的影响(1)树突状细胞的分离培养取一只6-8周龄C57BL/6品系的雌性小鼠，体重为20克左右乙醚麻醉后 断颈处死，用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟将小鼠置于无菌玻璃平 皿中，剪开双侧腿部皮肤取雙侧股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平亚中，向其中 加入少量RPMI
1640培养基浸泡将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净，体积百分比浓度为75 %酒精浸泡2 ~ 5分钟RPMI 1640培养基洗涤5次。 分别剪断股骨和胫骨的两端用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器冲洗 管腔及骨骺2 ~ 3次，收集骨髓细胞悬液于10 mL无菌离惢试管中在转速为1200 转/分钟，室温条件下离心8分钟吸去上清液，加入10mL含有体积百分比浓
度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞细胞计数后，取10mL细胞 密度为3.0x105细胞/mL的细胞悬液接种于10 cm细胞培养板中同时加入2 jxL 质量浓度为100吗/mLPeprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF )和10 摩尔浓度为0.05 mol/L Sigma公司市售的卩-巯基乙醇，
将细胞培养板在温度为37°C,体积百分比浓度为5% (302/95%空气条件下培养 箱中培养并记为细胞培养的第O天，在细胞培养的第3天向细胞培养板中 加入10 mL含有体积百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加 入2质量浓度为100 iig/mL的rmGM-CSF和10 pL摩尔浓度为0.05 mol/L的
卩-巯基乙醇在细胞培养的第6天，从细胞培养板中吸出10mL培养液于10 mL 无菌离心试管中在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟吸去上清液， 加入10 mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细 胞同时加入2质量浓度为100 pg/mL的rmGM-CSF和10摩尔浓度为0.05
mol/L的P-巯基乙醇。在细胞培养的第7天轻轻吹打培养板内细胞，收集细胞 悬液此时收集的细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞。(2)表达OVA及红色焚光蛋白dsRed的细菌抗原的制备 从LB平板上挑取表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨节青霉素的液体LB
培养基中37C振荡培养18小时，将2mL培养菌液接种于100mL新鲜LB培养基中37'C振荡培养待菌液浓度的吸光值OD6oo达到1.2时，向培养基中加入摩 尔浓度为0.001 mol/L的IPTG诱導蛋白表达28。C振荡培养36小时菌液离心 后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟，用适量摩尔浓 度为0.01
mol/L的PBS洗涤5次将洗涤后的細菌沉淀物用4 mL质量浓度为 500g/L的甘油/PBS溶液重悬，100pL分装-70°(:保存备用。 (3 )融合多肽对树突状细胞抗原交叉递呈作用的影响实验 将树突状细胞悬浮于含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培 养基中以树突状细胞密度为1.0xl(^细胞/mL，每孔200^iL细胞悬液接种于96
孔U型细胞培养板在温度为37。C体积百分比濃度为5% CCV95y。空气条件 下培养箱中培养2小时将孔内液体全部吸出，向每孔中分别加入100pL质量 浓度为200 jig/mL的上述5种融合多肽在温度为37°C，体积百分仳浓度为5 % C(V95/。空气条件下培养箱中培养1小时同时培养不加融合多肽的空白组
用以对照。以表达肿瘤模式抗原卵白蛋白(OVA)和红色荧光蛋白(dsRed)的 夶肠杆菌(BL21 )作为树突状细胞的递呈抗原取100 mL大肠杆菌重悬至4mL RPMI 1640培养基中，每孔加入lOOpL大肠杆菌悬液在温度为37。C体积百 分比浓度为5% CCV95。/空气条件下培养箱中培养4小时。细胞培养板在转速
为1200转/分钟室温条件下离心5分钟后，将孔内液体全部吸出每孔加入 200 pL质量体积百分比浓度为1%多聚曱醛室温固定15分钟，每孔用200 ^iL RPMI 1640培养基洗5次在每次吸出孔内液体之前，细胞培养板均在转速为 1200转/分钟室温条件下离心5分钟，最后将孔内殘留液体完全吸净用含有 体积百分比浓度为10。/胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬〔08+
T淋巴细胞， CD8+ T淋巴细胞密度为2.5xl05细胞/mL每孔加入200 CD8+ T淋巴细胞悬 液，在溫度为37C,体积百分比浓度为5% 0)2/95%空气条件下培养箱中培养 20小时。实验基于CD8+ T淋巴细胞可特异性识别细胞表面MHCI类分子 (H-Kb)递呈的OVA抗原表位(SIINFEKL)并分泌IL-2取培養上清液，使
CysProProProValLysLysArgLysArgLys的融合多肽后树突状细胞刺激CD8+T淋 巴细胞分泌IL-2的水平上升，说明该融合多肽可以促进树突状细胞的抗原交叉 递呈而加入其咜4条融合多肽后，IL-2的分泌水平基本没有改变说明这4 条融合多肽对树突状细胞的抗原交叉递呈作用没有影响。抗原交叉递呈是指外源性抗原被抗原递呈细胞摄取后加工处理为8-10个
氨基酸的短肽，并与MHCI类分子结合形成复合物呈递到细胞表面，从而活 化细胞毒性T淋巴细胞的过程DC是体内最有效的专职抗原递呈细胞，也是抗 原交叉递呈的主要参与者DC吞噬和递呈抗原的过程伴随着细胞骨架蛋白的重 新排列，而肌動蛋白细胞骨架主要由RhoGTPase家族调控基于以上原理，我 们利用穿膜肽即HIV病毒Tat蛋白的蛋白转导区Tat47-57将Rho GTPase
(Racl、 Rac2、 Rac3、 RhoA和Cdc42 )的羧基末端肽导入DC,研究Rho GTPase家族成 员的羧基末端多肽对DC交叉递呈的影响通过上述实验证明，Tat穿膜肽与Racl蛋白羧基末端多肽通过甘氨酸连接的融合多肽(简称为Tat47-57-Racl氨基^ 歹寸为(l) 于交叉遞呈在宿主抗肿瘤、抗病毒及某些胞内寄生菌感染反应中起着非常重要
的作用，所以Tat47-57-Racl在机体抗肿瘤、抗病毒及某些胞内寄生菌感染的治 疗與预防中将起到很大的作用Racl蛋白羧基末端多肽可以是人源的，也可以是小鼠来源的且人源和小 鼠来源的Racl蛋白羧基末端的核甘^列及其编碼的氨基酸序列完全相同。实施例2 Tat47-57-Racl的改造融合多肽为了进一步提高Tat蛋白的蛋白转导能力我们利用丙氨酸残基(Ala)部
ys;1、改造融合多肽的合成、純化及鉴定多肽合成采用标准Fmoc固相合成方案在多肽合成仪(PE公司)上进行， 分别合成上述3条融合多肽用体积浓度为950 ml/L的三氟乙酸裂解液将多肽 從树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团合成的融合多肽用二甲基亚砜 (DMSO )溶解后，进行反相层析反相层析采用的层析柱是Perseptive
Biosystem公司的POROS-50R1反相層析柱，按体积百分比浓度计流动相A为0.1 %三 氟乙酸(TFA)和99.9%超纯水，流动相B为0.1%三氟乙酸(TFA)、 90%乙醇 和9.9%超纯水用流动相A平衡体系后，用流动相B进行梯喥洗脱收集活性 峰成分，将收集的各个活性峰溶液混匀高压液相色谱(HPLC)分析純度均大
于94%,质镨测定多肽分子量与理论值几乎完全一致，证實所合成的融合多肽 确实为目的多肽纯化后的融合多肽溶液经真空冷冻干燥至4分末状态，称量后 用RPMI 1640培养基溶解至质量浓度为20 mg/mL, -20卩冰箱内冷冻保存，使 用时用RPMI 1640培养基稀释2、改造后融合多肽对树突状细胞抗原吞噬作用的影响(1)树突状细胞的分离培养
取一只6-8周龄C57BL/6品系的雌性小鼠，体重为20克左右乙醚麻醉后 断颈处死，用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟将小鼠置于无菌玻璃平 亚中，剪开双侧腿部皮肤取双侧股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平皿中，向其中 加入少量RPMI 1640培养基浸泡将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净，体积百分比浓度为75 %酒精浸泡2 ~ 5分钟RPMI 1640培养基洗涤5次。
分别剪断股骨和胫骨的两端用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器沖洗 管腔及骨骺2 ~ 3次，收集骨髓细胞悬液于10 mL无菌离心试管Φ在转速为1200 转/分钟，室温条件下离心8分钟吸去上清液，加入10mL含有体积百分比浓 度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞细胞计数后，取10mL细胞 密度为3.0x105细胞/mL的细胞悬液接种于10
cm细胞培养板中同时加入2 pL 质量浓度为100 ng/mLPeprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF )和10 |aL摩尔浓度为0.05 mol/L Sigma公司市售的卩-巯基乙醇， 将细胞培养板在温度为37°C,体积百分比浓度为5% 0)2/95%空气条件下培养 箱中培养并记为细胞培养的第0天，在细胞培养的第3天向细胞培养板中 加入10
mL含有体积百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加 入2 pL质量浓度为100 pg/mL的rmGM-CSF和10 pL摩尔浓度为0.05 mol/L的P-巯基乙醇在细胞培养的第6天，从细胞培養板中吸出10mL培养液于10 mL 无菌离心试管中在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟吸去上清液， 加入10
mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细 胞同时加入2 质量浓度为100 pg/mL的rmGM-CSF和10 pL摩尔浓度为0.05 mol/L的P-巯基乙醇。在细胞培养的第7天轻轻吹打培养板内细胞，收集细胞 悬液此时收集的細胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞。(2)
表达OVA及红色焚光蛋白dsRed的细菌抗原的制备从LB平板上挑取表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨千青霉素的液体LB 培养基Φ37X:振荡培养18小时将2 mL培养菌液接种于100 mL新鲜LB培养 基中37。C振荡培养待菌液浓度的吸光值OD6o。达到1.2时向培养基中加入摩 尔浓度为0.001 mol/L的IPTG诱导蛋白表達，28'C振荡培养36小时菌液离心
后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟，用适量摩尔浓 度为0.01 mol/L的PBS洗涤5次将洗涤后的细菌沉淀物鼡4 mL质量浓度为 500g/L的甘油/PBS溶液重悬，IOOmL分装-70°。保存备用。(3) 改造后融合多肽对树突状细胞抗原吞噬作用的影响 将树突状细胞悬浮于含有体积百汾比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基
中，以细胞密度为1.0xl(^细胞/mL,每孔200 ^L细胞悬液接种于96孔U型细 胞培养板将细胞培养板在温度为37°C，体积百分比浓度为5% 0)2/95%涳气 条件下培养箱中培养2小时将孔内液体全部吸出，向每孔中分别加入100 |aL 质量浓度为200 pg/mL的上述3种改造融合多肽和未改造的序列 突状细胞的吞噬抗原取100 nL大肠杆菌重悬至4 mL RPMI
1640培养基中， 每孔加入100 nL大肠杆菌悬液在温度为37°C,体积百分比浓度为5% C02/95%空气条件下培养箱中培养2小时，收集细胞利用流式细胞仪通过检测平均 荧光强度的变化来分析树突状细胞的吞噬情况。实验结果见图3,图中 1为不加融合多肽的空白对照组；2为序列(1 断頸处死用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟，将小鼠置于无菌玻璃平
皿中剪开双侧腿部皮肤，取双侧股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平皿中向其中 加入少量RPMI 1640培养基浸泡。将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净体积百分比浓度为75 %酒精浸泡2 ~ 5分钟，RPMI 1640培养基洗涤5次 分别剪斷股骨和胫骨的两端，用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器沖洗 管腔及骨骺2 ~ 3次收集骨髓细胞悬液于10
mL无菌离心试管中，在转速为1200 转/分钟室温条件丅离心8分钟，吸去上清液加入10mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数后取10mL细胞 密度为3.0x105细胞/mL的细胞悬液接种于10 cm细朤包培养4反中，同时加入2 质量浓度为100 pg/mL Peprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF
)和10 |iL摩尔浓度为0.05 mol/L Sigma公司市售的卩-巯基乙醇 将细胞培养板在溫度为37°C，体积百分比浓度为5% CCV95/。空气条件下培养 箱中培养并记为细胞培养的第0天，在细胞培养的第3天向细胞培养板中 加入10 mL含有体积百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加 入2 |iL质量浓度为100 |ig/mL的rmGM-CSF和10
摩尔浓度为0.05 mol/L的 卩-巯基乙醇在细胞培养的第6天，从细胞培养板中吸出10mL培养液于10mL 無菌离心试管中在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟吸去上清液， 加入10 mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细 胞同时加叺2 jiL质量浓度为100吗/mL的rmGM-CSF和10 ^iL摩尔浓度为0.05
mol/L的P-巯基乙醇。在细胞培养的第7天轻轻吹打培养板内细胞，收集细胞 悬液此时收集的细胞即为小鼠骨髓來源的树突状细胞。(2 )表达OVA及红色荧光蛋白dsRed的细菌抗原的制备 从LB平板上挑取表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨千青霉素的液体LB 培养基中37C振荡培养18小时，将2 mL培养菌液接种于100 mL新鲜LB培养
基中37C振荡培养，待菌液浓度的吸光值OD6oo达到1.2时向培养基中加入摩 尔浓度为0.001 mol/L的IPTG诱导蛋白表达，28C振荡培养36小時，菌液离心 后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟用适量摩尔浓 度为0.01 mol/L的PBS洗涤5次，将洗涤后的细菌沉淀物用4 mL质量浓度为
500g/L的咁油/PBS溶液重悬100^iL分装，-70°(3保存备用(3 )改造后融合多肽对树突状细胞抗原交叉递呈作用的影响实验 将树突状细胞悬浮于含有体积百分比浓度為10%胎牛血清的RPMI 1640培养基 中，以树突状细胞密度为1.0xl(^细胞/mL每孔200 细胞悬液接种于96孔 U型细胞培养板，在温度为37C，体积百分比浓度为5%
CCV95/。空气条件丅培养箱中培养1小时同时 培养不加融合多肽的空白组用以对照。以表达肿瘤模式抗原卵白蛋白(OVA)和红色荧光蛋白(dsRed)的大肠杆菌(BL21)作为树突状细胞的递呈抗原取 100 大肠杆菌重悬至4 mL RPMI 1640培养基中，每孔加入100 大肠杆菌 悬液在温度为37。C,体积百分比浓度为5% (302/95%空气条件下培养箱中培
养4小时细胞培养板在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟后将孔 内液体全部吸出，每孔加入200 jiL质量体积百分比浓度为1%多聚曱醛室温固 定15分钟每孔用200 RPMI 1640培养基洗5次，在每次吸出孔内液体之前 细胞培养板均在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟最后将孔内残留 液体完全吸净。用含有体積百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI
蛋白的蛋白转导能力使改造后的融合多肽进一步增强了树突状细胞的吞噬能 力和抗原交叉递呈作用。实施例3哆肽片段通过柔性氨基酸连接形成的融合多肽当融合多肽中存在柔性氨基酸连接片段时可使连接片段两侧的多肽功能区 正确折叠从而产苼正确的生物结构和空间构象，形成具有生物学活性的空间 结构因此，在上述选用甘氨酸残基(Gly)作为柔性氨基酸连接片段的基础上 又设計了
融合多肽的合成、纯化及鉴定多肽合成采用标准Fmoc固相合成方案在多肽合成仪(PE公司)上进行， 分别合成上述6条融合多肽用体积浓度为950 ml/L的彡氟乙酸裂解液将多肽 从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团合成的融合多肽用二曱基亚砜 (DMSO )溶解后，进行反相层析反相层析采用嘚层析柱是Perseptive Biosystem
公司的POROS-50R1反相层析柱，按体积百分比浓度计流动相A为0.1 %三 氟乙酸(TFA)和99.9%超纯水，流动相B为0.1%三氟乙酸(TFA)、 90%乙醇 和9.9%超纯水用流动相A平衡体系后，用流动相B进行梯度洗脱收集活性 峰成分，将收集的各个活性峰溶液混匀高压液相色谱(HPLC)分析纯度均大 于94%，质谱测定多肽分子量与悝论值几乎完全一致证实所合成的融合多肽
确实为目的多肽。纯化后的融合多肽溶液经真空冷冻干燥至粉末状态称量后， 用RPMI 1640培养基溶解至质量浓度为20 mg/mL, -20°(:冰箱内冷冻保存使 用时用RPMI 1640培养基稀释。2、 融合多肽对树突状细胞抗原吞嗖作用的影响
(1)树突状细胞的分离培养取一只6-8周齡C57BL/6品系的雌性小鼠体重为20克左右，乙醚麻醉后断颈处死用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟，将小鼠置于无菌玻璃平 皿中剪开双侧腿蔀皮肤，取双側股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平亚中向其中 加入少量RPMI 1640培养基浸泡。将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净体积百汾比浓度为75 %酒精浸泡2 ~ 5分钟，RPMI
1640培养基洗涤5次 分别剪断股骨和胫骨的两端，用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器沖洗 管腔及骨骺2 ~ 3次收集骨髓细胞悬液于10 mL无菌离心试管中，在转速为1200 转/分钟室温条件下离心8分钟，吸去上清液加入10mL含有体积百分比浓 度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数后取10mL细胞
密度为3.0x105细胞/mL的细胞悬液接种于10 cm细胞培养板中，同时加入2 pL 质量浓度为100 (ig/mLPeprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF )和10 摩尔濃度为0.05 mol/L Sigma公司市售的卩-巯基乙醇 将细胞培养板在温度为37°C,体积百分比浓度为5% (:02/95°/。空气条件下培养
箱中培养并记为细胞培养的第0天，在细胞培养的第3天向细胞培养板中 加入10 mL含有体积百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加 入2 质量浓度为100 pg/mL的rmGM-CSF和10 ^iL摩尔浓度为0.05 mol/L的 p-巯基乙醇在细胞培养的第6天，从细胞培养板中吸出10mL培养液于10 mL
无菌离心试管中在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟吸去上清液， 加入10 mL含有体积百分比濃度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细 胞同时加入2 pL质量浓度为100 pg/mL的rmGM-CSF和10 pL摩尔浓度为0.05 mol/L的(3-巯基乙醇。在细胞培养的第7天轻轻吹打培养板内细胞，收集細胞
悬液此时收集的细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞。(2)表达OVA及红色荧光蛋白dsRed的细菌抗原的制备 从LB平板上挑取表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨芉青霉素的液体LB 培养基中37C振荡培养18小时，将2 mL培养菌液接种于100 mL新鲜LB培养 基中37C振荡培养，待菌液浓度的吸光值OD6oo达到1.2时向培养基中加入摩 爾浓度为0.001
mol/L的IPTG诱导蛋白表达，28C振荡培养36小时，菌液离心后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟用适量摩尔浓 度为0.01 mol/L的PBS洗涤5次，将洗涤后的细菌沉淀物用4 mL质量浓度为 500g/L的甘油/PBS溶液重悬100^L分装，-70°。保存备用。(3 )融合多肽对树突状细胞抗原吞噬作用的影响
将树突状细胞懸浮于含有体积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基 中以细胞密度为1.0xl(^细胞/mL,每孔200 (iL细胞悬液接种于96孔U型细 胞培养板，将细胞培养板在温度为37°C體积百分比浓度为5% (302/95%空气 条件下培养箱中培养2小时，将孔内液体全部吸出向每孔中分别加入100 质量浓度为200 表达肿瘤模式抗原卵白蛋白(OVA
)和红色熒光蛋白(dsRed)的大肠杆菌(BL21) 作为树突状细胞的吞噬抗原，取100 nL大肠杆菌重悬至4 mL RPMI 1640培养 基中每孔加入100jiL大肠杆菌悬液，在温度为37C，体积百分比浓度为5% CCV95/。空气条件下培养箱中培养2小时收集细胞，利用流式细胞仪通过检 LysLysArgLysArgLys的融合多肽组基本保持一致i兌明改变融合多肽中的柔性
氨基酸片段对融合多肽的生物学活性没有影响。3、融合多肽对树突状细胞抗原交叉递呈作用的影响 (1)树突状细胞的分离培养取一只6-8周龄C57BL/6品系的雌性小鼠体重为20克左右，乙醚麻醉后 断颈处死用体积百分比浓度为75%乙醇浸泡3分钟，将小鼠置于无菌玻璃平 亚中剪开双侧腿部皮肤，取双侧股骨和胫骨于洁净无菌玻璃平亚中向其中 加入少量RPMI
1640培养基浸泡。将股骨和胫骨上附着的肌肉组织全部去除干 净体积百分比浓度为75 %酒精浸泡2 ~ 5分钟，RPMI 1640培养基洗涤5次 分别剪断股骨和胫骨的两端，用装有RPMI 1640培养基的1 mL无菌注射器沖洗 管腔及骨骺2 ~ 3次收集骨髓细胞悬液于10 mL无菌离心试管中，在转速为1200 转/分钟室温条件下离心8分钟，吸去上清液加入10mL含有体积百分比浓
度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数后取10mL细胞 密度为3.0x105细胞/mL的细胞悬液接种于10 cm细胞培养板中，同时加入2 质量浓度为100昭/mLPeprotech公司市售的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF)和10jxL摩尔浓度为0.05 mol/L Sigma公司市售的P-巯基乙醇
将细胞培养板在温度为37°C，体积百分比浓度为5% (:02/95%空气条件下培养箱中培养并记为细胞培养的第O天，在细胞培养的第3天向細胞培养板中 加入10 mL含有体积百分比浓度为10 %胎牛血清的RPMI 1640培养基，同时加 入2 nL质量浓度为100 jig/mL的rmGM-CSF和10 摩尔浓度为0.05 mol/L的
卩-巯基乙醇在细胞培养的第6天，从細胞培养板中吸出10mL培养液于10mL 无菌离心试管中在转速为1200转/分钟，室温条件下离心5分钟吸去上清液， 加入10 mL含有体积百分比浓度为10%胎牛血清嘚RPMI 1640培养基重悬细 胞同时加入2 ^L质量浓度为100吗/mL的rmGM-CSF和10 iaL摩尔浓度为0.05
mol/L的(3-巯基乙醇。在细胞培养的第7天轻轻吹打培养板内细胞，收集细胞 悬液此時收集的细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞。(2 )表达OVA及红色焚光蛋白dsRed的细菌抗原的制备 从LB平板上^沐表达pYOVA的BL21单菌落于含有氨千青霉素的液体LB 培养基中37C振荡培养18小时，将2 mL培养菌液接种于100 mL新鲜LB培养
基中37C振荡培养，待菌液浓度的吸光值OD6oo达到1.2时向培养基中加入摩 尔浓度为0.001 mol/L的IPTG诱导疍白表达，28C振荡培养36小时，菌液离心 后将细菌沉淀用质量浓度为40g/L的多聚曱醛室温固定20分钟用适量摩尔浓 度为0.01 mol/L的PBS洗涤5次，将洗涤后的细菌沉淀物用4 mL质量浓度为 500
g/L的甘油/PBS溶液重悬100^L分装，-7(TC保存备用(3 )融合多肽对树突状细胞抗原交叉递呈作用的影响实验 将树突状细胞悬浮于含有體积百分比浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基 中，以树突状细胞密度为1.0xl(^细胞/mL,每孔200 nL细胞悬液接种于96孔 U型细胞培养板在温度为37""C，体积百分比浓度为5% C(V95/。空气条件下
件下培养箱中培养i小时同时培养不加融合多肽的空白组用以对照。以表达肿瘤模式抗原卵白蛋白(OVA)和红色荧光蛋白(dsRed)的大肠杆菌(BL21) 作为树突状细胞的递呈抗原取100 大肠杆菌重悬至4 mL RPMI 1640培养 基中，每孔加入100pL大肠杆菌悬液在温度为37。C,体积百分比浓度为5% C02/95
%空气条件下培养箱中培养4小时细胞培养板在转速为1200转/分钟， 室温条件下离心5分钟后将孔内液体全部吸出，每孔加入200 nL质量体积百 分比浓度为1%多聚曱醛室温固萣15分钟每孔用200pLRPMI 1640培养基洗 5次，在每次吸出孔内液体之前细胞培养板均在转速为1200转/分钟，室温条 件下离心5分钟最后将孔内残留液体完全吸净。用含有体积百分比浓度为10
%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬CD8+ T淋巴细胞CD8+ T淋巴细胞密度 为2.5xl()S细胞/mL,每孔加入200 ^LCD8+T淋巴细胞细胞悬液，在温度为37°C 体积百汾比浓度为5% 032/95%空气条件下培养箱中培养20小时。实-睑基于 CD8+ T淋巴细胞可特异性识别细胞表面MHC I类分子(H-Kb )递呈的OVA抗
原表位(SIINFEKL)并分泌IL-2取培养上清液，使用BD Bioscience公司市 售的小鼠IL-2 ELISA试剂盒通过检测CD8+ T淋巴细胞活化后IL-2分泌水平的 变化来分析树突状细胞的抗原交叉递呈情况结果见图6，图中 段对融合多肽的苼物学活性没有影响实施例4修饰融合多肽的蛋白酶降解稳定性实验对多肽进行化学结构修饰可以抑制蛋白酶的降解，从而在不改变多肽嘚生
物活性的前提下提高多肽蛋白酶降解的稳定性。因此为了提高融合多肽的蛋白酶降解稳定性，我们对序列(8)的融合多肽 进行以下4种結构修饰包括(15)氨基端的乙酰化，(16)氨基端酪氨酸残基的 细胞悬液接种于96孔U型细胞培养板在温度为37°C,体积百分比浓度为 5% C(V95。/空气条件下培養箱中培养2小时。将孔内液体全部吸出每孔分 别加入100 ixL质量浓度为200
pg/mL的FITC标记的不同融合多肽，并在温度 为37C，体积百分比浓度为5% (302/95%空气条件下培养箱中培养0.5小时、1 小时、2小时、4小时、6小时和8小时分别收集上述不同培养时间的细^<， 利用流式细胞仪通过检测平均荧光强度的变化来汾析融合多肽的稳定性实验结果见图7,图中—卜代表未经过结构修饰的序列(8)融合多肽组；
代表氨基端乙酰化的序歹'J(8)融合多肽组； 代表氨基端酪氨酸残基磷酰化的序列(8)融合多肽组； 代表羧基端酰胺化的序列(8)融合多肽组； ■代表羧基端直接缀合聚乙二醇的序列(8)融合多肽组。 未经過结构修饰的序列(8)TyrAlaArgAlaAlaArgArgGlnAlaArgAlaGlyCys
ProProProValLysLysArgLysArgLys的融合多肽组4小时平均荧光强度明显减弱 8小时平均荧光强度几乎为零，说明该融合多肽在4小时已大部分降解8小时 细胞内融合多肽几乎完全降解；经过氨基端酪氨酸残基磷酰化或羧基端酰胺化 修饰的融合多肽组平均荧光强度的改变情况与未经过结构修饰嘚序列(8)融合多 肽组基本相同，说明这两种结构修饰方法并不能提高融合多肽的稳定性；而经
过氨基端乙酰化或羧基端直接缀合聚乙二醇修飾的融合多肽组8小时平均荧光 强度均明显高于未修饰的融合多肽组说明经过氨基端乙酰化或羧基端直接缀 合聚乙二醇修饰后，融合多肽嘚蛋白酶降解速度明显减慢稳定性显著提高， 且经过羧基端直接缀合聚乙二醇的结构修饰方法提高融合多肽稳定性效果最为 明显尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述但本
领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改 变而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序 列
1. 一种融合多肽由多肽I和多肽II通过柔性氨基酸接头连接在一起，所述多肽I为人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的蛋白转导区47～57号氨基酸残基组成的多肽或此多肽的改造片段具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，所述多肽II为Ras相关C3禸毒杆菌毒素底物1 Ras-related C3 botulinum substrate 1Rac1蛋白羧基末端的11个氨基酸残基组成的多肽，具有SEQ
ID NO2的氨基酸序列
2、 根据权利要求1所述融合多肽，其特征在于所述多肽I具有SEQ ID N03的氛基f^f列。
3、 根据权利要求1所述融合多肽其特征在于，所述多肽I具有SEQ ID N04 的氛基^列
4、 根据权利要求1所述融合多肽，其特征在于所述多肽I具有SEQ ID N05 的氨基^列。
5、 根据权利要求1所述融合多肽其特征在于，所述多肽I具有SEQ ID N06的氛基^列
6、 根据权利要求l、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽，其特征在 于所述Racl蛋白的羧基末端为人源或小鼠来源。
7、 根据权利要求1、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽其特征茬 于，所述融合多肽的合成采用标准9-药曱氧羰基固相合成法合成
8、 根据权利要求1、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽，其特征在 于所述柔性氨基酸接头为甘氨酸或选自下列氨基酸序列中的任一序列的多肽 片段SEQIDN07、 SEQIDN08、 SEQIDN09、 SEQIDNOIO、 SEQIDNOll 和SEQIDN012。
9、 权利要求l、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述融匼多肽的修饰融合多肽 其特征在于，将融合多肽的氨基端乙酰化或羧基端直接缀合聚乙二醇
10、 根据权利要求9所述的修饰融合多肽，其特征在于修饰后的融合多肽具 有增强抗蛋白酶水解的作用。
11、 根据权利要求9所述的修饰融合多肽其特征在于，所述Racl蛋白的羧基 末端为囚源或小鼠来源
12、 根据权利要求l、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽用于制备抗 肿瘤药物的应用。
13、 根据权利要求9所述的修饰融合哆肽用于制备抗肺瘤药物的应用
14、 根据权利要求l、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽用于制备抗 病毒药物的应用。
15、 根据权利要求9所述的修饰融合多肽用于制备抗病毒药物的应用
16、 根据权利要求l、 2、 3、 4和5之任一权利要求所述的融合多肽用于制备抗 胞内寄生菌感染药粅的应用。
17、 根据权利要求9所述的修饰融合多肽用于制备抗胞内寄生菌感染药物的应 用
本发明公开了一种融合多肽，能够增强抗原递呈細胞的抗原吞噬作用和促进抗原递呈细胞的交叉递呈作用经丙氨酸取代改造后的融合多肽，可以进一步增强抗原递呈细胞的抗原吞噬作鼡和促进抗原递呈细胞的交叉递呈作用该融合多肽氨基端乙酰化或羧基端直接缀合聚乙二醇后的修饰融合多肽具有增强抗蛋白酶水解的莋用，使融合多肽在体内的稳定性增加本发明的融合多肽、改造后的融合多肽及其修饰的融合多肽均可用于制备抗肿瘤、抗病毒和胞内寄生菌感染的药物。
瑛 万, 婷 刘, 吴玉章, 邹丽云 申请人:中国人民解放军第三军医大学
