【新闻事件】：1月4日美国证券交易委员会（SEC）公布，CRISPR基因编辑公司Editas Medicine递交了在纳斯达克挂牌上市的申请文件，计划募集1亿美元。同一天人们也开始注意到，之前吵得沸沸扬扬关乎Editas命脉的CRISPR专利战又有了一些变化：美国专利与商标局（PTO）证实，责任审查员Michelle Joike建议由上诉委员会直接审核以加州大学伯克利分校Jennifer Doudna和她的同事作为申请人的CRISPR专利申请。这种叫做“Interference proceeding”（专利抵触程序）的罕见专利审核程序意味着加州贝克莱的专利审核不再是传统意义上的专利授权，而是同时挑战之前已经授权的相关专利。程序上也更象法庭设置，由专利申请人和被挑战的授权专利发明人在三位法官评判下“当面对质”，以便确认专利的最终授权，即挑战者可以接手已授权专利。这样又把谁是“自DNA双螺旋结构之后基因工程领域最大的科学发现”的发明人这一热门话题再次带入公众视野。【药源解析】：CRISPR-Cas是在大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。当原核生物遇到外源的核酸比如病毒基因组或者质粒的时候，一些原核生物把一部分很短的外源序列整合到自己的一个或者多个CRISPR位点，接着CRISPR位点被转录生成CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA随后会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切未来入侵的外源核酸序列。所以俗称“魔术剪刀”的CRISPR-Cas9基因编辑技术是由一段介导RNA序列加上一个DNA水解酶Cas9组成，可以附着在基因组上几乎任何一个位置，并由Case9蛋白切开DNA序列的特定位点，然后在这个位点删除或添加特定的DNA片段（如图电影剪接）。所以CRISPR-Cas理论上不仅可以用作从基础研究到新药研发的工具，也可以修复变异的DNA因此作为药物治疗某些遗传疾病。除此之外CRISPR/Cas9使用简便、成本低廉，一些试剂公司比如Sigma/Aldrich已经开始接受不同CRISPR-Cas9的定制服务。《科学》杂志把CRISPR/Cas9基因编辑技术评为2015年最重要的“突破性发现”，更多科学家认为CRISPR/Cas9是自20世纪70年代生物技术时代以来出现的最重要的基因工程技术。&那么谁是最早发现、发明CRISPR/Cas9基因编辑技术的科学家呢？笔者以为应该至少从“CRISPR/Cas9的基础研究”，“CRISPR/Cas9在人类细胞中的具体应用”、和“CRISPR/Cas9基因编辑技术的法律发明人”三个方面讨论。&无容置疑，加州伯克利分校的结构生物学家Jennifer Doudna教授和德国亥姆霍兹医学研究中心的Emmanuelle Charpentier教授是最早报道把细菌天然免疫系统演变成CRISPR/Cas9基因编辑工具的科学家。2012年6月，Doudna/Charpentier联合课题组在《科学》杂志上发表CRISPR/Cas9作为基因编辑技术的第一篇研究论文，首次在体外证明CRISPR/Cas9技术可以切割任何的DNA链，指出CRISPR在活细胞中修改基因的能力，并且完整的讨论了CRISPR在基因组编辑上的可行性。正是Doudna和Charpentier的这些基础研究使CRISPR作为一种基因组编辑技术成为可能，也使生物学家认识到CRISPR/Cas9基因编辑技术的广阔应用前景。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因此也在2014年11月获得了由互联网巨头设立的奖金高达300万美元的生命科学突破奖（Breakthrough Prizes）。CRISPR被誉为本世纪到目前为止生物技术领域的最大突破。在CRISPR/Cas9技术于人类细胞中的具体应用领域，2013年1月，哈佛大学的George Church实验室和麻省理工学院/哈佛大学的Broad研究所的张锋课题组在同一期的《科学》杂志上发表文章，证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术被成功地运用到人类细胞的基因组，实现了CRISPR在哺乳动物细胞的基因编辑。几周后Jennifer Doudna也发表了她们自己实验室的类似结果。&在知识产权方面，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在号申报了CRISPR/Cas9基因编辑技术的第一个专利申请（优先权日期号），包含了该项技术在不同种类细胞中应用的155项权利要求。但到目前为止她们的所有CRISPR/Cas9专利申请都没有获得授权。麻省理工/哈佛Broad研究所的张锋也自号开始申报了CRISPR-Cas9技术在真核生物上进行了基因组编辑的超过20项专利（第一个CRISPR-Cas9专利申请到优先权日期是号）。广泛涵盖了该项技术在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中，以及针对不同适应症的各种应用。因为Broad研究所支付额外的费用，张峰的CRISPR/Cas9专利申请获得“快速通道”审核，PTO在2014年4月授予了张锋和Broad研究所首个CRISPR专利（专利号：US8697359）。到目前为止张峰的专利申请已经有14个获得授权，在欧洲也有4个已经被批准。&虽然Doudna/Charpentier联合课题组的专利申请早于张峰的CRISPR/Cas9专利申请，但因为直到日才实行新的“first to file规则”，而Doudna/Charpentier和张峰的专利申请都早于这个日期，美国专利授权仍按照较老版本的“first to invent规则”进行，即谁能够证明自己是第一个发明了CRISPR谁就获得专利，因此致使CRISPR/Cas9基因编辑技术的专利大战变得扑朔迷离。虽然Doudna和Charpentier于2012年5月就递交了专利申请，比张锋早7个月。但据说张锋提交了他的实验室笔记本后证实，他在2011年就开始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳动物细胞中的想法，并开始了CRISPR技术在人类细胞中的基因编辑，而且获得了第一个专利授权。当然，CRISPR/Cas9专利大战的胜负将取决于“CRISPR/Cas9基因编辑技术发明”的定义（是否在试管里进行基因编辑也算？，和这两个课题组谁能证明更早地成功地开展这些实验。如果Doudna/Charpentier的律师能使上诉委员会确信其《科学》文章发表后，CRISPR/Cas9基因编辑技术在细胞中如何使用变得显而易见（obviousness），Doudna/Charpentier也能赢得CRISPR/Cas9的最终专利授权。&从以上分析可看出，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、张峰、和George Church是相对独立地发明CRISPR/Cas9基因编辑技术的科学家，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技术的基础研究，而张峰和George Church在各种人类细胞中的应用方面贡献较多。至于CRISPR/Cas9技术的专利授权最终花落谁家，双方提供的证据说话。 (/)
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联系信箱：[转载]检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的副作用
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转自目前，弗吉尼亚大学医学院的研究人员设计出一种方法，检测风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑系统中意想不到的副作用。相关研究结果发表在最近的《Nature Biotechnology》。生物通
称为CRISPR的基因打靶系统，可让我们编辑基因组中特定靶位点的遗传信息。这种新方法揭示的系统，有可能会结合意想不到的位点，导致其中一些位点发生基因突变，这些突变可能对药物疗法的研究与开发，产生严重的后果。然而，这种新方法也可以确定一些途径，帮助阻止那些潜在危险的“脱靶”影响，让科学家们可以改进这种重要的新基因编辑系统所得到的结果。生物通
基因突变和如何避免它们弗吉尼亚大学生物化学和分子遗传学系的Mazhar Adli解释说，基因操作的一个主要目标是纠正有害突变，所以避免突变的意外引入，是至关重要的。生物通
他说：“我们知道，基因突变是疾病的标志。总体目标是，改变这些明显的遗传突变——去纠正这些突变。我们想，仅在靶向空间、靶向位点改变这些信息。如果你想改变任何其他信息，从根本上说，你就会引入你不想要的突变。你纠正一个基因，可能你就会在10个其他基因和基因组中的其他许多部位引入突变。”CRISPR：“研究的圣杯”生物通
Adli的新研究，揭示了CRISPR/Cas9基因编辑系统潜在的脱靶作用。该系统非常的受欢迎，因为它可让科学家操作活体哺乳动物基因组的特定部分，成为科学研究一种极其重要的工具。它已被迅速而广泛地采用，包括用于人类细胞研究，因为它相对简单，许多实验室都有资源来使用它。Adli称：“从根本上说，你可以靶定活细胞中的任何基因组区域，并改变遗传信息，这在过去几十年里一直是研究中的圣杯。从根本上说，能够靶定和改变活细胞中的遗传信息，是一个梦想。”生物通
这一新研究有助于解释支持CRISPR系统的机制，以及为什么它很容易受到脱靶基因突变的影响。Adli称：“我们不仅发现了它在基因组中的结合区域，还研究了为什么它定位到基因组中的这些区域。通过分析这些脱靶效应背后的特定序列，我们也找出了决定因素——为什么它靶定目标，而且也转到这些脱靶区域？我们的研究表明，它定位在那里，是因为与原始靶向区域的一些相似性。”生物通
“所以，我们的结果将有助于提高系统的特异性，以使我们能够最大限度地减少脱靶。”主要的突变影响生物通
Adli的这项研究也表明，在CRISPR系统使用的一种关键酶的自然野生型，与其改变的、不常用的酶形式相比，可引入更多的突变。前者在基因编辑过程中，切割DNA的双链，使突变发生，而后者只切割DNA的单链，使细胞能够修复损伤，而不引入突变。立即索取miRNA检测产品的相关资料生物通
他说：“很遗憾，野生型（自然发生的酶）更容易处理。所以，该领域的每个人都使用野生型酶。现在这篇论文和其他即将发表的论文中，他们将要停止使用野生型酶。他们必须使用改变了的酶形式，来克服脱靶效应。”（生物通：王英）生物通
延伸阅读：Science综述：CRISPR技术革命。您可能感兴趣的生物通精选文章：生物通
·北京大学Cell Res发表CRISPR研究新成果(06-04)·BMC Biology：含Cas酶的新型转座子(05-29)·PNAS解析CRISPR的DNA编辑机制(05-27)·Nucleic Acids Research：提高基因组编辑效率的新方法(05-20)·Science综述：CRISPR技术革命(05-16)生物通推荐原文摘要：Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease生物通
Abstract：RNA-guided genome editing with the CRISPR-Cas9 system has great potential for basic and clinical research, but the determinants of targeting specificity and the extent of off-target cleavage remain insufficiently understood. Using chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (ChIP-seq), we mapped genome-wide binding sites of catalytically inactive Cas9 (dCas9) in HEK293T cells, in combination with 12 different single guide RNAs (sgRNAs). The number of off-target sites bound by dCas9 varied from ~10 to &1,000 depending on the sgRNA. Analysis of off-target binding sites showed the importance of the PAM-proximal region of the sgRNA guiding sequence and that dCas9 binding sites are enriched in open chromatin regions. When targeted with catalytically active Cas9, some off-target binding sites had indels above background levels in a region around the ChIP-seq peak, but generally at lower rates than the on-target sites. Our results elucidate major determinants of Cas9 targeting, and we show that ChIP-seq allows unbiased detection of Cas9 binding sites genome-wide.
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作者：生物谷
来源：生物谷
关键词：基因编辑,CRISPRCas9
基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等。目前，基因组编辑有三大技术：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。与传统的TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9系统更便捷、高效，应用也更广泛，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及的基因组精确修饰。
CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR-associated），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、、果蝇、、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。
CRISPR/Cas9技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。2006年的诺贝尔奖获得者Craig Mello在接受美国国家公共电台采访时对CRISPR/Cas9赞不绝口；此外，在Cell杂志盘点的2013年度最佳论文中，CRISPR/Cas9也荣登榜单。
通过使用CRISPR/Cas9，科学家构建人类疾病小鼠模型的速度要比之前快得多。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、、果蝇、、线虫和农作物细胞中的目标基因，该技术在学领域得到广泛应用。
CRISPR-Cas9系统这种基因编辑器被专业人员寄予了厚望，其原因在于：采用这一技术可以更为迅速地改变或删除细胞中的多个基因，从而治疗一些性疾病，例如亨廷顿氏病，甚至可以治疗艾滋病等现在无法治愈的疾病。当然，这一技术还可以用于纠正体外受精胚胎的基因缺陷，从而创造新的健康生命。
然而，CRISPR-Cas9作为基因编辑的核心技术，它仍然是一项非常新颖的技术，除了存在“脱靶”的主要问题外，还有许多的技术难点尚未突破，尤其是临床应用的有效性和安全性依然是科学家关注和争论的焦点。因此，上，我们特邀请国内在基因编辑领域的顶尖专家和新锐科学家，在大会上发表演讲，他们将针对CRISPR-Cas9等重点技术展开深入讨论，向大家全面介绍基因编辑最新进展，以及未来应用方向。技术助力产业发展，我国技术在实现产业化和临床应用的过程中，既有机遇，又有挑战。如何突破技术创新、如何制定标准化，加强监管和审评，实现技术和产业的快速发展，任重而道远。
将于9月26日在上海举行，会议将继续以基因编辑为切入点，围绕基因编辑在开发中的应用，基因编辑在细胞治疗、蛋白表达中的应用，CRISPR-Cas9系统对维持与分化调控的研究，高通量基因组编辑与临床应用前景等方面展开详细叙述。（）
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(责任编辑：胡秋)
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