TMEM16A钙激活氯离子通道在_省略_上皮细胞的表达及其电生理特性研究_郝峰_百度文库
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你可能喜欢鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究
权志中 张丞斌 余 荣 刘长江摘 要 研究从鸡输卵管组织提取细胞总RNA，根据Gene Bank中已发表的鸡溶菌酶基因序列，设计合成特异引物，合成cDNA序列，并以此为模版，PCR扩增鸡溶菌酶基因。用Xho I和Xba I 对LYZ基因的PCR产物和真核表达载体pPIC6αA进行双酶切后转化到大肠杆菌(DH5α)中，构建成为真核重组表达载体pPIC6αA-LYZ。该载体经PstX I酶切线性化后，以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主菌X-33中，经Blasticidin抗性筛选，得到鸡溶菌酶基因重组毕赤酵母菌株；甲醇96 h（发酵罐诱导100 h）诱导表达，经Wetern-blot检测分析，基因重组工程菌株摇瓶诱导表达溶菌酶的表达量约为4 mg/l，发酵罐诱导表达的表达量约为10 mg/l。关键词 溶菌酶；克隆；表达；毕赤酵母中图分类号 Q55溶菌酶（lysozyme）是由英国细菌学家Fleming于1922年首先在人的眼泪和唾液中发现的，因其具有溶菌作用，被命名为溶菌酶。它广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然的抗菌剂，能特异性地作用于细胞壁N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，NAG）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，使微生物细胞在内部渗透压的作用下涨裂，细胞质外泄，最终导致细胞死亡。溶菌酶对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌有很好的抑菌作用，对人和动物的细胞则不发生溶菌作用，被WHO和许多国家认定为无毒、无害、安全的添加剂，被越来越广泛地应用于医药、生物技术、食品以及动物生产中。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，而且价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。利用分子生物技术构建基因工程菌，通过发酵手段生产溶菌酶，将是提高溶菌酶产量，降低成本的有效手段之一。毕赤酵母表达系统是近年发展迅速的高效真核表达系统，其表达载体上有一个醇氧化酶强启动子AOX1，可以甲醇作为唯一碳源诱导外源蛋白的高效表达。到目前为止，已经成功地表达了近百种外源蛋白。pPIC6αA真核表达载体中含有的α-factor，可实现胞外分泌表达，而毕赤酵母自身分泌极少的胞外蛋白，非常有利于表达蛋白的分离纯化。毕赤酵母表达鸡蛋清溶菌酶，在国外虽有报道，但国内还没有这方面的研究。本研究将鸡的溶菌酶基因通过克隆、重组、诱导等手段在毕赤酵母中成功地表达了有活性的鸡蛋清溶菌酶。1 材料与方法1.1 试验材料成年产蛋鸡购自农贸市场；质粒pPIC6αA、E.Coli DH5α及巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33均购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；PCR引物由上海桑尼生物公司合成；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Takara公司；小量质粒DNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；QIAprep spin质粒DNA纯化试剂盒购自上海天根生化科技有限公司；PCR产物凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；鸡蛋清溶菌酶标准品购自上海生物工程公司。1.2 试验设备PTC-100 PCR仪购自美国Bio-Rad公司;Eppendorf centrifuge 5415D和Eppendorf centrifuge 5417R低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；Backman低温高速离心机购自美国Backman公司；电泳仪购自天龙生物技术有限公司；恒温摇床购自美国New Brunswick Scientific公司；恒温培养箱购自上海恒科有限公司；凝胶成像仪为TANON GIS 2010，连接反应仪为ASTEC Block Incubator BI-515A；脱色摇床购自江苏海门麒麟医用仪器厂；转膜仪购自美国Bio-Rad公司；30 L发酵罐购自镇江东方生物工程设备技术公司；溶氧探头购自梅特勒公司；pH探头购自梅特勒公司,10 kDa和50 kDa聚砜树脂膜购自丹麦DDS公司。1.3 溶菌酶基因的克隆与扩增& 1.3.1 鸡输卵管组织样品的采集将用无菌剪刀采集1 cm3左右的新鲜的、的鸡输卵管组织，以无菌、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，液氮冷冻，置-70 ℃低温冰箱保存，参考《分子克隆试验指南》中的方法提取鸡输卵管组织总RNA，并通过RT-PCR反应制备cDNA。1.3.2 设计引物根据Gene Bank中报道的鸡输卵管溶菌酶（LYZ）mRNA序列（序列号：CR390743）设计正、反向PCR引物，并在引物两端分别引入XhoⅠ酶切位点和Xba I酶切位点，其序列分别为：LYZ-Xho I：5′-GGGCTCGAGAAAAGAAAAGTC TTTGGACGATGTGAG-3′LYZ-Xba I：5′-CCCTCTAGATCACAGCCGGCAG CCTCTGAT-3′1.3.3 PCR扩增鸡溶菌酶基因以LYZ-Xho I和LYZ-Xba I为引物，以制备的cDNA为模版扩增鸡溶菌酶基因。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min后,然后分为两个阶段,条件分别为95 ℃变性1 min、52 ℃退火1 min、72 ℃延伸45 s,10个循环；95 ℃变性1 min、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸45 s,共30个循环。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,参照PCR产物凝胶回收试剂盒方法回收目的片段。1.4 重组表达载体pPIC6αA-LYZ的构建用Xho I和Xba I 对LYZ基因的PCR产物和真核表达载体pPIC6αA进行双酶切后,纯化回收目的片段，在T4噬菌体DNA连接酶的作用下进行连接，转化到大肠杆菌(DH5α)中,涂布含100 μg/ml Blasticidin抗性的LB平板上，37 ℃温箱内生长过夜，挑取20株克隆作cloning PCR检测。PCR反应体系为：ddH2O 7.3 μl、10×PCR Buffer（Mg2+）1 μl、25 mmol/l dNTP 0.5 μl、10 μmol/l LYZ-Xho I primer 0.5μl，10 μmol/l LYZ-Xba I primer 0.5 μl、Taq polymerase 0.2 μl，挑取少量克隆作为模版。PCR条件为：95 ℃预变性4 min，然后95 ℃变性45 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，共30个循环，最后维持在4 ℃。挑选5株cloning PCR检测为阳性的克隆菌株分别接种到含有100 μg/ml Blasticidin抗性的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min振荡过夜，按照常规方法少量抽提质粒DNA，经酶切鉴定确定为阳性克隆。1.5 cDNA测序与分析对上述重组质粒进行限制性酶切分析，插入片段大小正确的重组质粒，上海桑尼生物技术公司分别用5′-AOX1和3′-AOX1引物对cDNA作正向和反向测序分析。所获序列用BioEdit软件进行分析和拼接，并用BLAST程序与Gene Bank中已报道的鸡输卵管LYZ序列进行比对。1.6 毕赤酵母基因工程菌株的筛选将pPIC6αA-LYZ质粒DNA经PstX I酶切线性化后,以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主菌X-33中,电击条件为:使用0.2 cm电击杯，2.0 kV,5.5 ms。电击后迅速加入1 ml冰冷的1 mol/l 山梨醇,转入15 ml离心管,28 ℃温箱内静置孵育1～2 h,然后分别取50、100、200 μl涂布含有100 μg/ml Blasticidin抗性的YPAD平板,28 ℃温箱内培养2～3 d,每天观察菌落生长情况,筛选生长快速且抗Blasticidin的阳性克隆菌株。1.7 诱导表达鸡蛋清溶菌酶1.7.1 摇瓶诱导表达重组溶菌酶挑选1.5中的阳性克隆菌落，置于装有100 ml BMGY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、4×10-5％生物素、1% 甘油、100 mmol/l pH值6.0磷酸盐缓冲液)的500 ml摇瓶中，28 ℃、200 r/min振荡培养12～14 h；室温下1 500~3 000 g离心5 min，收集并用BMMY重悬菌体，使OD600达到1.0左右（约100~200 ml）；加入50 ml无菌水洗涤菌体沉淀重复收集菌体1次；加入20 ml BMMY培养基培养收集的菌体，28 ℃振荡培养，200 r/min，诱导表达96 h；每24 h取0.5 ml诱导培养液,1 500~3 000 g离心5 min,收集上清液,同时向剩余的发酵液中补加0.5%发酵初始体积的无水甲醇,以添加甲醇诱导作为计时零点,测定每次取样的溶菌酶表达水平,以确定最佳表达时机。1.7.2 发酵罐诱导表达重组溶菌酶按1％的比例将过夜培养于BMG培养基中的高效表达溶菌酶酵母菌株接种至已经灭菌的装有上罐发酵基本培养基（每升含：85％磷酸26.7 ml、硫酸钙0.93 g、硫酸钾18.2 g、七水硫酸镁14.9 g、氢氧化钾4.13 g、甘油40.0 g、PTM1 trace salts 4.35 ml）的发酵罐中，在充分消耗发酵培养基中的甘油后，流加补料培养基1（含1.2%PTM1培养基的50％甘油溶液），流加量为18 ml/（l?h）持续约6 h至湿细胞重约385 g/l，开始流加补料培养基2（含1.2%PTM1培养基的100％甲醇溶液）诱导表达，在开始的3 h内，流加量控制在1 ml/(l?h),接下来的2 h内流加量控制在7.2 ml/(l?h),最后流加量调节至10 ml/(l?h),直至诱导结束,诱导时间总计100 h,诱导发酵过程中溶氧度始终控制在20％以上,流加25％氨水维持发酵液pH值在5.5左右。以流加补料培养基2诱导表达作为计时零点,每隔24 h取样10 ml,离心取上清液于-80 ℃保存备用。发酵结束,离心分离发酵液用于溶菌酶纯化及酶活性分析。1.8 表达产物的鉴定1.8.1 SDS-PAGE电泳制备两块SDS-PAGE凝胶，取不同时间点采集的溶菌酶表达样品加入6×Loading Buffer沸水浴煮沸5 min,同时上样两块SDS-PAGE凝胶,用鸡蛋清溶菌酶作为阳性对照,甲醇诱导前的上清液作为阴性对照。电泳结束后,取其中一块用考马斯亮兰染色30 min,然后摇床脱色；另一块用于检测溶菌酶的表达量。1.8.2 Western-blot检测样品经SDS-PAGE电泳分离后将蛋白经Bio-Rad电转移槽转到纤维素膜上。纤维素膜在含5％脱脂奶粉的PBST（8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4、2 ml Tween-20、ddH2O定容至1 L）内4 ℃放置过夜，加入1：10 000稀释的兔抗鸡溶菌酶抗体，室温摇床上反应1 h；PBST洗膜4次，每次洗涤15 min；加入二抗（1：10 000稀释的羊抗兔IgG酶标抗体）室温摇床上反应1 h；PBST洗膜4次，每次洗涤15 min；加底物显影，暗室内压片、冲洗胶片。1.8.3 表达量的检测取表达上清液和已知浓度的溶菌酶阳性对照品分别加入6×Loading Buffer煮沸5 min后，分别以1×Loading Buffer将以上样品以2、4、8倍稀释，上样同一块SDS-PAGE凝胶，电泳结束后转纤维素膜，然后经Western-blot检测，方法同1.8.2。1.9 表达产物的浓缩取5 L发酵液，经5 000 r/min离心10 min后，分离表达上清液，通过50 kDa的聚砜树脂膜超滤去除大分子蛋白，过滤液再经过10 kDa聚砜滤膜滤除大部分的水和小分子物质，最后用15 ml pH值6.2的磷酸钠缓冲液反向洗脱，得表达产物浓缩样品。1.10 溶菌酶活性检测接种溶壁微球菌至LB中，37 ℃振荡过夜,离心后弃上清液,以去离子水洗涤2次，调节OD600至0.01,取1 ml涂布LB固体培养基平板,自然风干。剪相同直径的圆形滤纸片,平铺在平板上,滤纸片上滴加15 μl浓缩样品和不同浓度的鸡蛋清溶菌酶标准品（20 000 U/mg）,37 ℃温箱内培养12 h，测定形成的抑菌圈的直径来估算表达溶菌酶的溶菌活性。2 结果与分析2.1 溶菌酶基因的克隆不含编码信号肽序列的溶菌酶基因大小约为400 bp，本研究从鸡输卵管组织提取细胞总RNA，反转录合成cDNA序列，再经PCR扩增后，扩增产物上样1%琼脂糖凝胶电泳检测与理论基本一致，结果见图1。 2.2 溶菌酶重组表达载体的构建与鉴定（见图2）克隆的溶菌酶cDNA以PCR扩增后，再经Xho I和Xba I双酶切，PCR产物以凝胶纯化试剂盒纯化（图2a）。表达载体pPIC6αA经Xho I和Xba I双酶切后形成线性表达载体（图2b），并回收目的片段。将以上经Xho I和Xba I双酶切后的溶菌酶基因和pPIC6αA表达载体在T4 DNA连接酶的作用下连接构建成为含有溶菌酶基因的重组表达载体，对构建的表达载体作Bgl II、BamH I和Nco I三酶切鉴定，结果见图2c，分别获得1.9、1.4和0.5 kb的酶切产物，与理论分析完全一致。2.3 cDNA测序与分析克隆的鸡溶菌酶基因测序分析后,经BioEdit进行比对分析,所克隆的鸡输卵管溶菌酶 cDNA 序列与已发表序列比对发现,共发生了4个位点的核苷酸突变,分别为A30→G、C93→T、T230→A、T294→C。推导的氨基酸序列经BioEdit比对分析,与已报道的鸡蛋清溶菌酶相比有一个位点的氨基酸发生了改变(Ile77→Asn)(见图3)。经蛋白质分析软件AnthePro 5.0进行结构预测及功能分析，结果表明,该位点没有位于溶菌酶活性中心,分析可能不会对溶菌酶的功能产生影响,可用于进一步构建溶菌酶基因重组表达载体。2.4 表达产物的鉴定对诱导表达（摇瓶诱导和发酵罐诱导）的样品进行SDS-PAGE 和Western-blot分析，结果显示，无论摇瓶诱导还是发酵罐诱导在与溶菌酶阳性对照相同的位置均有一条特异的条带，并且随诱导表达时间的延长，此条带愈显浓重，见图4（a、b、c、d）。结果表明经过甲醇的诱导，鸡蛋清溶菌酶基因在毕赤酵母菌株成功实现了分泌表达，而且表达量随着诱导时间的延长呈现出递增的趋势，见图4（b、d）。为了标定诱导表达溶菌酶的表达量，采用与已知的不同浓度溶菌酶标准样品同时上样，经Wetern-blot检测，对检测结果作比对分析，结果表明摇瓶诱导表达的溶菌酶表达量约为4 mg/l，而发酵诱导表达时溶菌酶的表达量约为10 mg/l，见图5。2.5 活性检测为检测溶菌酶的抑菌特性,取15 μl经抽滤浓缩的表达上清液滴加在涂布溶壁微球菌LB琼脂平板的滤纸片上,以LYZ标准品作为阳性对照,37 ℃放置12 h。结果见图6,观察抑菌圈的情况。在滴加表达上清液的滤纸片周围形成一个圆形的抑菌圈,直径约为12 mm,与40 μg溶菌酶阳性对照组形成的抑菌圈相接近,表明重组表达的溶菌酶可有效抑杀溶壁微球菌的生长。3 讨论本试验从成年母鸡的输卵管中提取鸡总RNA，通过逆转录的方式，构建毕赤酵母重组表达载体pPIC6αA-LYZ，并以电穿孔法将之转化到毕赤酵母细胞中，通过甲醇诱导成功实现了鸡溶菌酶基因在摇瓶和发酵罐中的分泌表达。以SDS-PAGE和Western-blot对诱导表达不同时间的取样进行分析，表明重组菌株诱导表达了溶菌酶，而且在诱导过程中，随诱导时间的增加表达量有递增趋势。经Wetern-blot检测,对检测结果作比对分析,摇瓶诱导表达的溶菌酶表达量约为4 mg/l，而发酵诱导表达时溶菌酶的表达量约为10 mg/l。但此结果比Tetsuya M等（2005）的400 mg/l的表达结果低很多，具体原因还需进一步分析。通过活性检测表明，表达的溶菌酶能够有效抑制溶壁微球菌的生长，证实了原来第77位氨基酸改变不影响溶菌酶活性的推断。如何通过表达载体的合理构建，多克隆菌株的筛选，发酵条件的优化等关键措施的改进，大幅度提高重组毕赤酵母溶菌酶的表达量，将是实现溶菌酶工业化发酵生产的关键。
（编辑：高 雁，）XhoI和BamH I 双酶切80ul反应体系_百度作业帮
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XhoI和BamH I 双酶切80ul反应体系
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你用的哪家公司的酶？ 不同公司的酶的体系是不同的。尤其是buffer。短小芽孢杆菌质粒pCJ3的限制酶切图谱--《中山大学学报(自然科学版)》1985年04期
短小芽孢杆菌质粒pCJ3的限制酶切图谱
【摘要】：从短小芽孢杆菌A3菌株分离的具四环素抗性质粒pCJ3,经电泳法及氯化铯密度梯度法纯化后在琼脂糖凝胶电泳上得到2条带,经电镜观察及限制酶切割证实是一种质粒的两种构型——超线团及开环DNA分子。纯化质粒用13种限制酶进行酶切试验,发现其中有BamH I、Ava I、Xba I切点1个,EcoR I、Pst I、Bgl I、Hinc Ⅱ及Xho I切点2个、Hinf I、Sal I及Bel I切点3个,Hha I切点5个,Hind Ⅲ没有切点。用BamH I、EcoR I、Ava I及Xba I进行双酶解,并根据双酶解后的琼脂糖凝胶电泳带估算出各个片段的分子量,作出质粒pCJ3的4种限制酶的酶切图谱。
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
基甲工程目前主要采用大肠杆菌及基质粒烤为飞D“A分子克隆的受体一载体索统·由于大倾托菌是人体肠道的共生菌,出于安全考虑寻找其它的无性繁殖系统是必要:戳戳巍黔燃i嵘滋簌l多数是隐蔽质粒,无选择标记,不适宜作载体·我们从短小芽抱杆菌中分离的质粒纂抗四环素标记,并做了
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菊花生长素响应蛋白Aux/IAA 编码基因CmIAA1 及其植物表达载体和构建方法
项目编号：
技术简要说明
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAA1表达载体构建。本发明所构建的表达载体pCAMBIA?1301-CmIAA1是由CmIAA1基因插入到克隆载体pMD19-T?simple?vector，经BamH?I和Xba?I双酶切后连接到载体pCAMBIA?1301的BamH?I和Xba?I位点而得到的重组质粒。将该植物表达载体用于植物遗传转化，CmIAA1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成Aux/IAA蛋白，影响生长素信号途径，对植物生长发育产生负调控作用，抑制植物主根伸长，促使侧根增多，并抑制植物整体生长进度。
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专利类型：发明
专利申请日：
公开(公告)日：
申请(专利权)人：南京农业大学
申请人：南京农业大学
公开(公告)号：CNA
分类号：C12N15/29(2006.01)I
发明(设计)人：陈素梅;杨冬寅;陈发棣;蒋甲福;李佩玲;顾春笋;管志勇;房伟民;刘兆磊;滕年军
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