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作业二 (3)
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端粒和端粒酶是如何保护染色体的？
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你好，很高兴为你解答，看下面。。端粒使DNA末端处于高度凝集状态，避免了DNA酶的降解，避免了染色体融合，从而维持了遗传骸定囤感塬啡剁拾筏浆信息的稳定性。随着DNA复制的进行，端粒会变短，端粒酶就会发挥作用，募集相关的蛋白或酶，延长端粒到合适长度。 端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5'到3' 方向的链富含 GT。在酵母和人中，端粒序列分别为C1－3A/TG1－3和TTAGGG/CCCTAA，并有许多蛋白与端粒DNA结合。端粒DNA主要功能有：第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止染色体相互融合；第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点, 常可抑制位于端粒附近基因的转录活性（称为端粒的位置效应，TPE）。在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的，另外，重组机制也介导端粒的延长。端粒与人体衰老挂上了钩：第一、细胞愈老，其端粒长度愈短；细胞愈年轻，端粒愈长，端粒与细胞老化有关系。衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列。当细胞端粒的功能受损时，就出现衰老，而当端粒缩短至关键长度后，衰老加速，临近死亡。第二、正常细胞端粒较短。细胞分裂会使端粒变短，分裂一次，缩短一点，就像磨损铁杆一样，如果磨损得只剩下一个残根时，细胞就接近衰老。细胞分裂一次其端粒的DNA丢失约30～200bp(碱基对)。第三、研究发现，细胞中存在一种酶，它合成端粒。端粒的复制不能由经典的DNA聚合酶催化进行，而是由一种特殊的逆转录酶——端粒酶完成。正常人体细胞中检测不到端粒酶。一些良性病变细胞，体外培养的成纤维细胞中也测不到端粒酶活性。但在生殖细胞、睾丸、卵巢、胎盘及胎儿细胞中此酶为阳性。令人注目的发现是，恶性肿瘤细胞具有高活性的端粒酶，端粒酶阳性的肿瘤有卯艇癌、淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌等等。人类肿瘤中广泛地存在着较高的端粒酶耥端挝酶作为肿瘤治疗的靶点，是当前较受关注的热点之一。
摘要：端粒对维持染色体的稳定和延长细胞寿命至关重要，其长度的维持有赖于端粒酶的存在，布莱克本和绍斯塔克发现端粒中的一种独特DNA序列能保护染色体免于退化。格雷德和布莱克本发现了端粒酶及其作用，这些发现揭示了端粒形成和端粒酶保护染色体的机理，3位美国科学家因此荣获2009年诺贝尔生理学或医学奖。
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端粒使DNA末端处骸定囤感塬啡剁拾筏浆于高度凝集状态，避免了DNA酶的降解，避免了染色体融合，从而维持了遗传信息的稳定性。随着DNA复制的进行，端粒会变短，端粒酶就会发挥作用，募集相关的蛋白或酶，延长端粒到合适长度。
端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5'到3' 方向的链富含 GT。在酵母和人中，端粒序列分别为C1－3A/TG1－3和TTAGGG/CCCTAA，并有许多蛋白与端粒DNA结合。端粒DNA主要功能有：第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止染色体相互融合；第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点, 常可抑制位于端粒附近基因的转录活性（称为端粒的位置效应，TPE）。在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的，另外，重组机制也介导端粒的延长。端粒与人体衰老挂上了钩：第一、细胞愈老，其端粒长度愈短；细胞愈年轻，端粒愈长，端粒与细胞老化有关系。衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列。当细胞端粒的功能受损时，就出现衰老，而当端粒缩短至关键长度后，衰老加速，临近死亡。第二、正常细胞端粒较短。细胞分裂会使端粒变短，分裂一次，缩短一点，就像磨损铁杆一样，如果磨损得只剩下一个残根时，细胞就接近衰老。细胞分裂一次其端粒的DNA丢失约30～200bp(碱基对)。第三、研究发现，细胞中存在一种酶，它合成端粒。端粒的复制不能由经典的DNA聚合酶催化进行，而是由一种特殊的逆转录酶——端粒酶完成。正常人体细胞中检测不到端粒酶。一些良性病变细胞，体外培养的成纤维细胞中也测不到端粒酶活性。但在生殖细胞、睾丸、卵巢、胎盘及胎儿细胞中此酶为阳性。令人注目的发现是，恶性肿瘤细胞具有高活性的端粒酶，端粒酶阳性的肿瘤有卯艇癌、淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌等等。人类肿瘤中广泛地存在着较高的端粒酶耥端挝酶作为肿瘤治疗的靶点，是当前较受关注的热点之一。
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端粒与端粒酶的研究_解读2009年诺贝尔生理学或医学奖|端​粒​,​端​粒​酶
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人的类RecD解旋酶Pif1通过抑制端粒酶活性调控端粒延伸
【摘要】：端粒是真核生物线状染色体的末端结构,由端粒DNA和其结合蛋白组成。它在维持基因组的稳定、防止染色体DNA末端融合和降解中起着重要的作用,并与癌症、衰老密切相关。端粒DNA重复序列的延伸是由特化的反转录酶即端粒酶完成的。端粒酶的核心组分是由具有催化活性的蛋白质亚基(hTERT)和RNA亚基(hTR)组成,hTR为合成端粒DNA重复序列提供模板。
以前的研究发现芽殖酵母Pif1解旋酶通过抑制端粒酶途径来抑制端粒DNA的加长。端粒DNA复制的基本机制从酵母到人都高度保守,而类Pif1基因在多种生物中都广泛存在。因而,本研究的主要目的是鉴定人Pif1蛋白,是否也参与了端粒DNA的复制和维持。本工作首先克隆了人Pif1的cDNA。一级结构及生化分析表明,人Pif1蛋白是大肠杆菌RecD潜在的同源蛋白;具有依赖于ATP的5'至3'的DNA解旋酶活性。在端粒酶阳性的HT1080细胞中过表达野生型hPif1蛋白可导致细胞端粒DNA缩短,抑制hPif1过表达可使端粒DNA长度恢复。人Pif1对端粒DNA长度的影响需要其ATPase/解旋酶活性,因为丧失ATPase/解旋酶活性的突变体过表达不影响端粒DNA的长度。在端粒酶阴性的GM487细胞中过表达hPif1不影响端粒变化,提示hPif1蛋白对端粒DNA的效应是通过端粒酶通路介导的。体外生化实验还显示,重组Pif1蛋白可通过降低端粒酶的进行性从而直接抑制端粒酶的活性,而且,hPif1解旋酶能够解开DNA/RNA杂合双螺旋。染色质免疫沉淀还证实hPif1结合在端粒DNA上。基于这些实验结果,我们推测hPif1通过把端粒酶RNA从端粒DNA上解离下来而抑制端粒酶介导端粒DNA的加长。类RecD解旋酶在生物进化过程中已获得新功能。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）【学位级别】：博士【学位授予年份】：2006【分类号】：Q343【目录】：
ABSTRACT4-5
英文缩写5-10
图表目录10-13
一、引言13-33
1. 端粒和端粒酶的研究历史13-15
2. 端粒结合蛋白与端粒长度调控15-25
2.1 双链结合蛋白15-22
2.1.1 TRF1 及其调控蛋白15-20
2.1.1.1 TRF1 (telomeric-repeat binding factor 1)15-16
2.1.1.2 TRF1 的调控蛋白16-20
2.1.1.2.1 Pin2 (NIMA-interacting protein 2)16-18
2.1.1.2.2 端锚ADP核糖聚合酶Tankyrase (TRF1 interacting ankyrin related ADP ribose polymerase)18-19
2.1.1.2.3 TIN2 (TRF1-interacting nuclear factor219
2.1.1.2.4 PinX1 (Pin2/TRF1-interacting protein19-20
2.1.2 TRF2 及有关端粒结合蛋白20-22
2.1.2.1 TRF2 (telomeric-repeat binding factor 2)20
2.1.2.2 调节TRF2 的蛋白20-22
2.1.2.2.1 hRAP1 (human repressor-activator protein 1)20-21
2.1.2.2.2 BLM和WRN21
2.1.2.2.3 核内不均一核糖核蛋白21
2.1.2.2.4 Rad50/Mre11/Nbs121-22
2.1.2.2.5 DNA依赖的蛋白激酶和Ku蛋白22
2. 2 单链结合蛋白22-25
2. 2. 1 端粒末端保护蛋白 122-24
2. 2. 2 其它物种的端粒单链DNA结合蛋白24-25
3. 端粒酶及其活性调控25-29
3.1 表达调控27
3.2 活性调控27-29
3.2.1 hTERT与 14-3-327-28
3.2.2 hTERT 与HSP9028-29
3.2.3 hTERT 与Ku29
4. 解旋酶与端粒复制调控29-31
5. Pif1 解旋酶亚家族31-33
二、 材料与方法33-51
1. 人Pif1 cDNA的克隆与亚克隆33
2. 制备并纯化抗体33-35
3. hPif1 融合蛋白在酵母中的表达和纯化35-36
3.1 构建酵母表达载体pEG(KT)-hPif1ΔN及pEG(KT)-hPif1~(K234A)ΔN35-36
3.2 GST融合蛋白在酵母表达系统中的小量纯化36
4. DNA/RNA解旋酶活性测试36-37
5. 稳定表达株筛选37-38
5.1 转染用的质粒的制备37
5.2 磷酸钙法转染细胞37
5.3 筛选稳定转染株37-38
6. 可诱导的基因表达系统38
7. 细胞传代培养38
8. 免疫沉淀38-39
9. MTT比色法测定细胞生长速率39
10. FACS法细胞凋亡分析39
11. Northern分析39-41
11.1 样品总 RNA 的抽提39-40
11.2 polyA~+ mRNA的分离40
11.3 Northern blot 杂交40-41
12. 端粒DNA印记杂交及端粒长度测定41-43
12.1 抽提基因组DNA41
12.2 限制性酶切、消化基因组DNA与电泳分离41-42
12.3 Southern转移42
12.4 预杂交和杂交42
12.5 脉冲场电泳-端粒Southern印记42-43
13. 利用GFP融合蛋白进行细胞定位研究43
13.1 基因转染及细胞铺片的制备43
13.2 hPif1 在转染细胞中表达的检测43
14. 细胞免疫荧光43-44
15. 染色质免疫沉淀(ChIP)44-45
16. 细胞核蛋白的制备45
17. 体内泛素化试验45
18. Beta-半乳糖苷酶检测系统45
19. 基于端粒重复序列扩增法端粒酶体外抑制试验45-46
20. 人端粒酶体外重建46
21. 端粒酶直接测活试验46-47
22. hPif1 蛋白的种系进化分析47
23. 引物与寡核苷酸序列47-51
三、结果51-91
1. 人Pif1 全长cDNA的克隆51
2. 人Pif1 蛋白是一种的大肠杆菌RecD同源蛋白51-55
3. 人Pif1 蛋白的四种多克隆抗体的制备55-59
4. 人Pif1 基因在端粒酶阳性细胞株中表达,但在端粒酶阴性细胞无表达59-63
5. 人Pif1 蛋白具有 5’至 3’的DNA解旋酶活性63
6. 细胞中Pif1 蛋白水平受泛素介导的蛋白质降解系统调控63-65
7. 过表达hPif1 不影响细胞的生长65-72
8. 过表达有ATP酶/解旋酶活性的hPif1 导致端粒的缩短72-78
9. 抑制hPif1 的表达可恢复端粒的长度78-80
10. hPif1 在体内通过抑制端粒酶通路抑制端粒的延伸80
11. hPif1 在体外抑制端粒酶的活性80-83
12. 人Pif1 蛋白在体外降低端粒酶的进行性 (与周波合作的工作)83
13. 人Pif1 蛋白具有RNA/DNA解旋酶活性83-87
14. 在体内和体外,hPif1 蛋白与端粒DNA结合87-91
四、讨论91-102
1. 人Pif1 研究工作的总结91
2. Pif1 亚家族与RecD亚家族91-93
3. 真核生物的RecBCD同源物的探寻93-95
4. 人Pif1 蛋白与酵母Pif1 蛋白95-96
5.Pif1 解旋酶亚家族成员大多参与端粒复制调控96-97
6.hPif1 抑制端粒酶活性的分子机理97
7.端粒酶活性调控的进展97-99
8.解旋酶参与端粒酶活性调控99
9.人Pif1 基因与人类疾病99
10. 展望99-102
五、 参考文献102-117
六、 发表研究论文117
七、 在读期间申请的专利117
八、 参加国内国际会议117-118
九、 获奖118-119
十、 致谢119-120
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