免疫胶体金医学检验中的应用
核心提示：摘要免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一，问世二十多年来发展十分迅速，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作了较系统介绍。
摘要免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一，问世二十多年来发展十分迅速，在生物医学各领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作了较系统介绍。
1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(D ot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg 、HCG 和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。
免疫胶体金技术的基本原理
氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、、激素、牛血清多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
胶体金的制备方法
胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。
1、玻璃容器的：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
2、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。
金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸(pH3～5.8) 、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5～10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。
3、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：
取0.01%氯金酸水溶液100ml 加热至沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液 0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在 535nm，A1cm/535=1.12。 金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。
金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表。 附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1%柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00金溶胶颜色蓝灰、紫灰、紫红、红、橙红、橙吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15
4、柠檬酸三钠-鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法如下：取 4ml1%柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml1%鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2(体积与鞣酸加入量相等)，以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃取1ml1%的 HAuCl4，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至60℃，然后迅速将上述柠檬酸-鞣酸溶液加入，于此温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需0.5～1小时)后，将溶液加热至沸腾，保持沸腾5分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。
5、白磷还原法：在120ml双蒸馏水中加入1.5ml1%氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。
要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数(CV)可小于15%。
免疫胶体金制备
1、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
2、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
3、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：
①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。 ②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2～3ml)，搅拌2～3分钟。 ③加入5ml1%PEG20000溶液。 ④于1g离心30～60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件)，小心吸去上清液(切忌倾倒)。 ⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A1cm/540nm=1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠钠防腐，置4℃保存。 ⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。 以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存
胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。
金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。
当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。
免疫胶体金的应用
1、胶体金在电镜水平的应用
胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。
胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。
金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。
实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗测，因此，可同时适用于和诊断。
2、胶体金在光镜水平的应用
胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。 胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。
3、胶体金在流式细胞仪中的应用： 应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。
4、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。
5、免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法(或免疫荧光、RIA)进行定量。
免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌A蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。 利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。 由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。
6、胶体金在肉眼水平的应用 胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2②不需γ-计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用;③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与;④实验结果可以长期保存;⑤时间大大缩短，提高了检测速度。
金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。
胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用
免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
早孕诊断用的免疫层析试纸条(通常又叫尿妊纸条)的装配结构见图一。
装配方法：在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α-HCG玻璃纤维、已固定有抗β-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状，即为尿妊用纸条。
本法检测速度快，一般一两分钟可出结果;灵敏度高，可达50IU/L;好的试纸条结果也是准确可靠的，这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗β-HC G的特异性。
金标尿妊纸条虽然好用，但在使用中也必须注意以下几个方面：一是温度，试纸条虽然可在室温保存，但大批暂时不用的试纸条还是应该放在4℃保存，以免抗体失效，从冰箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温，然后才打开密封，可避免反应线模糊不清。二是正确操作，一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃端滴入2滴(约100微升)尿液，或将吸尿端直接标本中，深度约10～15毫米20秒，取出后平放，这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法是取尿标本约0.5ml 加入小试管中，然后插入试纸条，待1～2分钟反应带清晰后观察结果。
胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用
ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用，特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ELISA法由于操作程序复杂，时间较长，给实验室带来不便。因此出现一步法快速检剂盒，虽可提高检测速度，但有出现假阴性结果的弊端。ELISA法需时较长的主要原因，是由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间，将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法(Dot-immunogold filt ration assay)，又称滴金免疫法。
快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于膜上的特异性抗原+标本中的相应抗体+金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色。
结果判断：快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有以下不同的判定结果。
快速斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，已应用于多种临床检测项目。
以上分析可以看出，胶体金标记技术是继三大标记技术之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。
（实习编辑：陈战锋）
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谈谈兽医学中的常规血清学诊断技术以及与分子生物学技术相结合的诊断技术背景：
日期：作者：无忧论文网编辑：xiaoch点击次数：56销售价格：免费论文论文编号：lw202554论文字数：&论文属性：职称论文论文地区：中国论文语种：中文&
关键词：&&&&&&
免疫学在兽医中侧重于免疫血清学诊断和免疫防治。在疾病的诊治中更是依靠免疫学诊断技术快速、准确地诊断出传染病病原和传播途径,对于传染病的预防控制尤为重要。免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体,或是利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答,在生物体内产生生物T细胞的克隆扩增和效应增强,并分泌特异性的免疫球蛋白―抗体。由于抗原抗体结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位、定量地检测某一特异的抗原或抗体。病原体侵入动物体后,病原体的蛋白、核酸或是病原体本身都会成为抗原而引起机体的免疫应答。随着病原体的不同,机体免疫的应答也表现出不同的差异。通过检测病原体感染后产生的抗体或病原体本身的抗原就能达到检测疾病的目的。血清凝集抑制试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验等血清学诊断技术均已广泛用于动物传染病、寄生虫病的诊断与监测,无论是灵敏度,抑或是特异性都有了极大的提高,仍是传染病诊断领域重要的检测手段之一。随着生物化学与分子生物学等学科,以及相关技术的飞速发展,免疫学研究亦已进入了分子水平时代,而且向其他许多学科渗透,已成为生命科学研究不可缺少的一门科学。目前在疾病诊断、控制技术的研究中,也不断取得新的进展,发展了许多新的检测技术。斑点ELISA、聚合酶链反应-ELISA、免疫转印技术、生物芯片技术,将各种生物技术结合起来,才能帮助我们及时、准确地诊断传染病,发现病原体,控制传播途径,并找到有效的治疗方案。1 常规血清学诊断技术1.1 血清凝集抑制试验(HI)因为许多动物病毒能够凝集某种类动物的红细胞,由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体与病毒结合后,血凝素即不能吸附于红细胞表面的受体上。HI不象其它血清学试验,不需要种属特异的结合〔1,2〕,因此特异性不好。一般检测快速,用于大量筛选野生或饲养的动物样品中的抗体。1.2&补体结合试验(CF)由于一个抗体分子与抗原结合后,可以导致数百个补体分子的激活,呈现一定的放大作用,所以补体结合试验是一个比较敏感的方法。虽然在某些病毒型的鉴定上,补体结合试验的检测能力有时不及中和试验和血凝抑制试验,但补体结合试验稳定,特异性高,重复性好,一直仍用于动物血清学中特异性抗体的定量检测〔3〕。1.3&免疫荧光抗体技术通过显微镜标本的免疫荧光染色而显示其结果,由于病毒抗原的标记比较困难,常用标记抗体检查未知抗原,此技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术的快速性,并可以在细胞水平上进行抗原定位,故在病毒学研究和诊断中都是一种应用很广的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可检测海洋微生物,尤其是细菌〔8〕,避免了细菌培养,从而提供了特异、快速的检测方法。1.4&酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA是应用最广的一项免疫学诊断技术,以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上,随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验,无论是病毒病、禽传染性支气管炎抗体检测〔9〕、禽多瘤病毒特异性抗体检测〔10〕,还是细菌,例如牛布鲁氏杆菌病〔11,12〕,或是寄生虫引起的疾病、犬弓形体病〔13〕、羊肝片吸虫〔14〕,都应用到了酶联免疫吸附试验技术。因此,ELISA在各种动物疾病诊断上发挥了重要的作用。ELISA作为根除控制计划的初筛方法是非常理想的,费用相对较少,比常用的血清学方法有明显的优点,不需要抗体的第二特征,例如血凝性、结合补体的能力〔11〕,用时少,敏感性、重复性、特异性好,可筛选检测大量的样品〔15〕。利用纯化的抗原,单克隆抗体可提高反应检测的特异性〔9,10,11〕。1.5&斑点酶联免疫吸附试验将酶标反应板换成硝酸纤维膜,即为斑点酶联免疫吸附试验,将少量的试剂点在硝酸纤维膜或其它能结合蛋白的膜上,同抗原特异的抗体以及酶结合抗体反应,加入能形成不溶性有色沉淀的底物,使固相膜染色,形成有颜色的斑点,直接判读结果。利什曼原虫病〔16〕,牛呼吸道合包体病毒〔17〕,无钩绦虫〔18〕,免疫寄生虫〔19〕,克服了显微镜检查的麻烦。因硝酸纤维素膜吸附性能强,一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条,并在同一张膜条上点有多种抗原,将整个膜条与同一份血清反应,则可同时获得对多种疾病的诊断结果,3种主要禽类疾病的同时检测〔20〕,多种蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已广泛应用于动物疾病的诊断。免疫血清学技术的发展趋向一直是高度特异性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,试验电脑化,反应微量化,方法标准化和试剂商品化,以及方法简便、快速。随着生物化学和分子生物学等学科迅速发展,相继出现了许多新的诊断技术,可以从分子水平对疾病的致病机理,诊断、治疗和预防进行研究。2 与分子生物学技术相结合的诊断技术2.1 PCR-ELISA将PCR技术与ELISA相结合的一种抗原检测技术,又称免疫PCR。该技术是由Sano T等在1992年建立的,其本质是一种以PCR技术代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进ELISA,利用ELISA技术检测PCR扩增的产物〔3〕。利用了PCR的指数扩增效率带来极高的敏感度,同时又具有高的特异性的抗原检测系统。用亲和素包被微孔板,封闭后,加入标记于捕获探针3’端的生物素,而捕获探针5’端和待检靶序列5’端的一段互补,通过生物素和亲和素的交联作用,将捕获探针固定在微孔板上,制成固相捕获系统。其次PCR缓冲液中加入一定比例的地高辛标记的DUTP,经PCR扩增后,扩增产物与微孔板上的捕获探针进行液相杂交,带有地高辛的靶序列即被捕获,再在微孔板中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体,再加入底物如TMB显色,进行ELISA检测。此法具有高灵敏度,检测结果可靠,可以进行半定量检测的优点,可用于病毒的检测、疾病诊断和目的基因检测。此方法较常规PCR灵敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鉴定PCR产物更快速,判定结果客观,易于操作,尤其在筛选大量品时,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常规PCR中,由于非特异的产物和不名原因引起的条带反应,而作出的主观解释〔23〕。可筛选大量食源性病原体,帮助加工厂监测食品的污染水平,进行危险品分析〔24〕。尤其在寄生虫检测方面,以前多用血涂片,而现在应用PCR-ELISA检测牛巴贝虫〔25,26〕、布鲁氏锥虫〔27〕时,灵敏度可以提高1000倍,特异性强,至少较显微镜方法早一周检测出寄生虫。PCR-ELISA相对于凝胶光密度定量,在检定灵敏度、特异性、准确度上都有很大的提高〔28〕。2.2&免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelec-trotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southernblot相类似,亦被称为
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2013年&28卷&3期
刊出日期：
临床应用研究.论著
汤荣华，黄建军
类风湿性关节炎患者血清GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-&的水平测定及临床意义
目的 检测类风湿性关节炎（RA）患者血清中性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素17（IL-17）和肿瘤坏死因子&（TNF-&）的水平，探讨这些细胞因子在RA发病过程中的意义。 方法 收集门诊RA患者血清81例（静止期36例、活动期45例），健康对照组血清50例，评估RA患者疾病活性分数28（DAS28），应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-&的水平，结果用中位数（四分位数间距）表示。结果 GM-CSF在静止期、活动期RA患者和健康对照组血清中的浓度分别为12.7（9.7）、27.4（34.8）和6.2（5.2）pg/mL；IL-6在3组血清中的浓度分别为8.5（10.5）、47.1（43.8）和4.7（5.3）pg/mL；IL-17在3组血清中的浓度分别为19.3（16.4）、23.4（19.5）和20.8（16.1）pg/mL；TNF-&在3组血清中的浓度分别为42.7（37.2）、76.2（42.4）和34.1（21.9）pg/mL；活动期RA患者血清中GM-CSF、IL-6和TNF-&的水平显著高于静止期RA患者和健康对照组（P＜0.01）；静止期RA患者血清中GM-CSF、IL- 6和TNF-&的水平显著高于健康对照组（P＜0.05）；IL-17在3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。RA患者组中，GM-CSF与IL-6和TNF-&显著相关（r＝0.637、0.738，P均＜0.001）；GM-CSF与IL-17无相关性（r＝0.171，P＝0.426）。RA患者DAS28与GM-CSF、IL-6和TNF-&显著相关（r＝0.583、0.656、0.758，P均＜0.001）。 结论 GM-CSF、IL-6和TNF-&在RA的发病过程中具有重要作用； GM-CSF对于调节RA 患者IL-6和TNF-&的水平可能具有重要意义。
2013&Vol. 28&(3):&173-177
吉强，顾星，周军，陈冬梅，殷月鹏，高春芳
乙型肝炎患者肝移植前后实验室常规检测指标的变化及意义分析
目的 分析乙型肝炎患者行肝移植手术前后实验室常规检测指标的变化特征，探讨患者手术前后及恢复过程中的规律和特点。 方法 回顾性分析44例术前采用抗病毒治疗的肝移植受者术前和术后1、10、20、30 d丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）、总胆汁酸（TBA）、碱性磷酸酶（ALP）、&-谷氨酰基转移酶（GGT）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、前白蛋白（PAlb)、血糖（GLU）、凝血酶原时间（PT)、部分凝血活酶时间（APTT）、血小板（PLT)以及乙型肝炎病毒（HBV） DNA载量等各项指标的变化规律，结果用中位数（范围）表示。 结果 AST和ALT术前分别为70.2（15.5 ～ 539.6）IU/L和44.1（5.8 ～ 255.5）IU/L，术后1 d急剧上升至1 506.4（172.4 ～ 5 195.3）IU/L和749.1（142.2 ～ 2 874.2）IU/L，术后10 d快速下降至117.3（17.2 ～ 900.4）IU/L和135.3（27.5 ～ 1 237.1）IU/L，术后20 d接近正常水平。GGT和ALP术后1 d活性稍下降，10 d后上升，30 d后大部分患者仍保持高水平。TBil和DBil术后较术前大多持续下降，30 d后接近正常。TP、Alb术后1 d稍下降，10 d后基本恢复正常水平，而PAlb术后持续升高。 TBA术后持续下降。PT和APTT术后明显延长，10 d后基本恢复正常。PLT术后下降，10 d后基本恢复正常。除2例术前、术后乙型肝炎血清标志物和HBV DNA无明显变化外，其余42例肝移植患者术后血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）全部转阴，乙型肝炎表面抗体（抗HBs）全部转阳，HBV DNA水平低于检测下限。 结论 肝移植术外加抗病毒和免疫学的综合治疗方案，可使HBsAg、乙型肝炎e抗原（HBeAg）发生血清学转换并大大降低血清中HBV DNA检出率和乙型肝炎复发率。肝移植围手术期常规检测指标改变的规律和特点可能为临床病情判断提供依据。
2013&Vol. 28&(3):&178-182
葛国兴，钟亚萍，梁美春
绍兴地区0～14岁儿童纤维结合蛋白参考区间建立
目的 探讨本地区健康儿童纤维结合蛋白（Fn）水平，建立儿童医学参考区间。 方法 选择652例0～14岁肝、肾、心、肺功能均正常的儿童为研究对象，其中男童360名，女童292名，分别按年龄段0～1岁、2～3岁、4～14岁分3组。用免疫透射比浊法原理在Abbott Aeroset型全自动生化分析仪检测Fn，测定结果用美国临床实验室标准化协会（CLSI）C28-A2进行统计处理。 结果 按年龄段，健康男童Fn区间分别为：131.9~270.8 &g/mL、132.9~284.8 &g/mL、132.5~270.3 &g/mL(P＞0.05)，0~14岁健康男童参考区间为132.8~272.2&g/mL；女童为142.6~306.4&g/mL、135.6~284.2&g/mL、136.0~264.0&g/mL(P＞0.05)，0~14岁健康女童参考区间为137.5~285.4&g/mL。 结论 实验室有必要根据CLSI C28-A2文件的规定建立自己的参考值范围，供不同临床科室参考。
2013&Vol. 28&(3):&183-185
顾其龙1，凤敏华2
上海奉贤地区708例外来务工妇女宫颈疾病液基细胞学及人乳头瘤病毒检测结果分析
目的 研究上海奉贤地区外来务工妇女宫颈疾病发生及高危型人乳头瘤（HR-HPV）感染情况。 方法 回顾性分析上海奉贤区708例因疑似宫颈疾病就诊的外来务工妇女液基细胞学和HR-HPV检测结果，以及部分患者的活检病理结果和宫颈环形电切（LEEP）病理结果。 结果 上述患者中非典型鳞状细胞(ASC)、低度鳞状上皮病变(LSIL)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)的发生率分别为31.6%、23.2%和11.9%，HR-HPV的感染率为68.4%。随着年龄的增长，LSIL发生率显著降低，HR-HPV感染率逐渐降低，而HSIL发生率则逐渐升高。HR-HPV阳性的ASC和LSIL患者中活检病理结果为宫颈细胞内瘤样病变2（CIN2+）及以上病变的比例分别为35.7%和37.8%。HSIL患者中85.7%活检病理或LEEP病理结果为CIN2+。 结论 上海奉贤地区外来务工妇女中宫颈细胞病变的发生率较高，且相当一部分患者在就诊时就已经出现高级别病变。
2013&Vol. 28&(3):&186-188
王立新1，胡祎明2，胡志东1，田彬1，李静1，王凤霞1，杨华1
血流感染患者金黄色葡萄球菌erm基因检测及流行病学研究
目的 了解2006年1月至2011年8月临床血流感染患者红霉素耐药金黄色葡萄球菌红霉素核糖体甲基化酶（erm）基因分布特点及流行情况。 方法 收集2006年1月至2011年8月引起血流感染的39株红霉素耐药金黄色葡萄球菌。应用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪及配套鉴定卡、药物敏感性卡对细菌进行鉴定及药物敏感性试验。头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），并以D试验测定红霉素对克林霉素的诱导耐药表型。聚合酶链反应（PCR）分别检测ermA、ermB、ermC基因。脉冲场凝胶电泳（PFGE）和葡萄球菌染色体mec（SCCmec）分型方法了解产ermA金黄色葡萄球菌的流行情况。&结果 39株红霉素耐药金黄色葡萄球菌对克林霉素、青霉素、庆大霉素的耐药率高，分别为100.0%、92.3%、53.8%。8株（20.5%）红霉素耐药而克林霉素敏感株D试验全部为阳性结果。erm基因的携带率为100.0%，ermA、ermB、ermC基因检出率分别为25.6%（10/39）、46.2%（18/39）、46.2%（18/39）；红霉素对克林霉素诱导耐药株ermC基因携带率为75.0%（6/8），ermA基因携带率25.0%（2/8）。PFGE分型结果显示10株携带ermA基因的MRSA为6个不同克隆株，SCCmec分型结果显示8株为SCCmecⅢ型菌株，2株未能分型。 结论 在引起血流感染的红霉素耐药金黄色葡萄球菌中erm基因携带率高，ermA基因多分布于MRSA中，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）主要携带ermB基因，红霉素对克林霉素诱导耐药株主要携带ermC基因。携带ermA基因菌株全部为MRSA，主要是SCCmecⅢ型，对多种药物耐药，并存在散在克隆传播现象。
2013&Vol. 28&(3):&189-193
赵付菊1，刘华勇2，周丽芳1，方毅1，庞立峰1，刘文健1，赵虎1
泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性和同源性分析
目的 分析泛耐药鲍曼不动杆菌（PDRAB）的耐药性、同源性及感染病例的临床特征和治疗情况，为指导临床合理用药、控制感染提供依据。 方法 收集临床分离自住院患者的鲍曼不动杆菌，用法国生物梅里埃VITEK-2 Compact全自动细菌分析仪及药敏纸片法分析菌株耐药性。选取PDRAB感染的病例，用回顾性统计分析方法分析PDRAB感染病例的临床特征及疗效转归；用微量板半定量法检测PDRAB 菌株的生物膜形成能力；用脉冲场凝胶电泳法分析PDRAB 菌株的同源性。 结果 共收集鲍曼不动杆菌138株，其中PDRAB 菌株11株，占7.97%；选取PDRAB感染的病例10例，其中呼吸重症监护室7例（70%）、普外科2例（20%）、普通重症监护室1例（10%）。10株PDRAB对多黏菌素B敏感率为100%，对目前所有常规的抗菌药物耐药率为100%。138株鲍曼不动杆菌菌株中生物膜阳性7株（5.07%），其中PDRAB 2株、非PDRAB 5株。10株PDRAB 菌株共分为7型(A、B、C、D、E、F、G)，其中D和E型中的2株菌株的同源性高，其余为散发株。 结论 呼吸重症监护病房泛耐药现象严重，长期广谱抗菌药物的使用、侵入性诊疗，合并多种基础疾病与感染发生密切相关，多种抗菌药物联合使用对控制PDRAB 感染有一定疗效。PDRAB耐药机制复杂，应以呼吸重症监护室为防控重点，同时加强对生物膜阳性菌株所分布的病区的耐药性监测。
2013&Vol. 28&(3):&194-198
赵倩，汪雅萍，应春妹，郑冰，张灏旻，杨俊
质粒介导aac(6&)-Ib基因检测与喹诺酮类耐药
目的 了解大肠埃希菌临床株对喹诺酮类抗菌药物耐药情况并分析质粒介导aac(6&)-Ib基因存在与喹诺酮类药物耐药性的关系。 方法 采用纸片扩散法(K-B)对临床中段尿分离所得121株大肠埃希菌进行耐药性检测，聚合酶链反应(PCR)法检测大肠埃希菌aac(6&)-Ib基因，对aac(6&)-Ib基因阳性菌株扩增片段进行DNA测序并确定基因型。 结果 大肠埃希菌临床株对萘啶酸、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星4种喹诺酮类抗菌药物耐药率均高于75%。aac(6&)-Ib基因检出率为14.0%（17/121），经DNA测序确定aac(6&)-Ib基因变异体(cr)有14株，突变率为82.4%(14/17)；aac(6&)-Ib基因阳性株对氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢唑啉、头孢克洛、头孢呋辛、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星耐药率高于阴性株且差异有统计学意义（P&0.05）。 结论 仁济医院临床分离大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药情况严重；质粒介导aac(6&)-Ib基因的存在可使大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药性提高；质粒介导aac(6&)-Ib基因还可能引起细菌对&-内酰胺酶抑制剂药物和头孢菌素类药物敏感性下降。
2013&Vol. 28&(3):&199-202
潘畅1，林炜栋1，周钢1，陈向芳2
江浙沪皖地区18～22周岁男性血镉、尿汞参考区间探讨
&目的 探讨江苏（简称江）、浙江（简称浙）、上海（简称沪）、安徽（简称皖）地区18～22周岁男性血镉、尿汞参考区间，为消防员职业健康体检的重金属筛查提供更为切合实际的参考标准。 方法 使用原子吸收分光光度法对1 683名新入伍消防员进行血镉测定。使用酸性氯化亚锡还原法进行尿汞测定，结果采用肌酐（Cr）校正。再对血镉、尿汞值进行统计学分析，参考区间按P0～P95计算；同时分地域、是否吸烟比较。 结果 江浙沪皖地区18～22周岁男性血镉值呈正偏态分布，参考区间为0～6.70 &g/L；尿汞值呈正偏态分布，参考区间为0～3.00 &g/g Cr；地域之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；吸烟与非吸烟组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 血镉、尿汞参考区间应区分不同地区、不同年龄建立参考区间。
2013&Vol. 28&(3):&203-206
曾婷婷，黄玉霞，王登朝，黄茜，陈姣，粟军
泌尿系统结石症患者尿液电导率的改变
目的 调查健康人群及泌尿系统结石患者尿液电导率的变化，探讨尿液电导率的临床应用。 方法 收集健康人群436名，超声多普勒确诊的肾脏、输尿管结石患者348例，使用UF1000i尿沉渣自动分析仪检测尿液电导率。 结果 健康人群随机尿液电导率呈正态分布；40岁以上人群较40岁及以下人群电导率降低（P＜0.001）；肾脏、输尿管结石患者电导率均比正常人降低（P＜0.001）；结石大小不同的人群间电导率无差异；以电导率作为尿路结石的诊断性实验做受试者工作特征（ROC）曲线，其曲线下面积＜0.3。 结论 泌尿系统结石患者尿液电导率下降，而结石大小对电导率变化不构成影响。尿液电导率不能作为泌尿系统结石的诊断性实验，但可以作为筛查实验，结合尿沉渣分析仪的其他检测指标提示临床医生进行超声多普勒检测确诊泌尿系统结石。
2013&Vol. 28&(3):&207-210
张梁1，元辉雄1，黄永秩2
结直肠癌组织中HNF4&的细胞内定位及临床意义
目的 检测肝细胞核因子4&（HNF4&）在结直肠癌组织中的细胞内定位及其表达情况，探讨HNF4&定位及其表达与结直肠癌临床各病理因素的关系。 方法 应用免疫组化方法检测132例结直肠癌组织标本及其癌旁正常组织中HNF4&的细胞内定位及其表达情况。 结果 结直肠癌组织中HNF4&蛋白分子的表达定位于细胞浆或细胞核；结直肠癌组织细胞浆HNF4&的阳性率（76.5%）显著高于癌旁正常组织（3.8%，P＜0.05）；结直肠癌组织细胞核HNF4&的阳性率（12.9%）显著低于癌旁正常组织（64.4%，P＜0.05）；HNF4&在结直肠癌组织细胞浆中的表达与组织分化程度及Dukes分期有关(P＝0.02、P＝0.03)，与性别、年龄、肿瘤位置、有无淋巴结转移等临床病理特征无明显相关性(P均＞0.05)。 结论 结直肠癌组织中HNF4&在细胞浆中高表达或在细胞核中低表达，HNF4&的细胞内定位异常可为结直肠癌的诊断及预后判断提供客观依据。
2013&Vol. 28&(3):&215-217
李建青1，丁鸿燕2，叶银才2
子宫内膜异位症不孕患者卵泡液VEGF的变化及意义
目的 探讨子宫内膜异位症不孕患者血清和卵泡液中血管内皮生长因子（VEGF）的变化。 方法 应用酶联免疫吸附试验（ELISA）对20例子宫内膜异位症不孕患者（内异症组）及20例非子宫内膜异位症不孕患者（对照组）分别进行血清和卵泡液的VEGF测定。 结果 内异症组患者血清和卵泡液VEGF水平均显著高于对照组（P＜0.001），卵泡液VEGF水平高于血清（P＜0.001）。卵泡液VEGF诊断子宫内膜异位症不孕的敏感性明显高于血清VEGF。 结论 卵泡液中VEGF水平的改变在临床上对子宫内膜异位症不孕的诊断更具参考价值。
2013&Vol. 28&(3):&233-235
联合检测CA15-3、CA125、CEA对乳腺癌的临床价值探讨
目的 探讨糖类抗原（CA）15-3、CA125和癌胚抗原（CEA）联合检测对乳腺癌的临床价值。 方法 采用化学发光免疫分析法检测93例乳腺癌患者、85例乳腺良性肿瘤患者及80名正常对照者血清CA15-3、CA125和CEA水平；将93例乳腺癌患者按临床分期标准分为Ⅰ～Ⅱ期50例、Ⅲ期26例、Ⅳ期17例。比较各组3项指标的检测结果并计算阳性率及联合检测的阳性率。 结果 正常对照组、乳腺良性肿瘤组及乳腺癌组CA15-3、CA125和CEA水平依次增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。乳腺癌组CA15-3、CA125、CEA水平随着临床分期的增高而相应增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。乳腺癌组CA15-3、CA125、CEA阳性率分别为46.2%、31.2%、17.0%，三者联合检测阳性率为76.3%，均高于乳腺良性肿瘤组和正常对照组（P＜0.05）。 结论 CA15-3、CA125和CEA联合检测对乳腺癌具有良好的辅助诊断价值。
2013&Vol. 28&(3):&235-237
董晓妮，张文灏
关于免疫透射比浊法测定波长选择的探讨
近年来随着大型全自动生化分析仪的普及以及免疫诊断的发展，免疫透射比浊法检测项目不断增加，正确理解和设置生化分析仪参数对提高分析敏感性和特异性以及保证检验结果的准确性有重要的指导作用。采用免疫透射比浊法原理测定的项目参数设置具有一定的特殊性，我们仅就测定波长的选择进行了探讨。
2013&Vol. 28&(3):&210-214
彭乃杰，李克诚，夏菲，阎绍荣，钱定良
血清同型半胱氨酸水平与急性脑梗死的相关性研究
脑梗死是由于血栓或栓子脱落阻塞脑血管，导致局部脑组织血流中断、缺血缺氧进而软化坏死。近几年的国内外有关脑梗死的危险因素的研究发现，在传统危险因素之外，血中同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)水平增高是脑梗死的独立危险因素之一[1]。? HCY又称为高半胱氨酸，是一种含巯基氨基酸，为蛋氨酸代谢途径中形成的一种中间产物。随着检测技术的发展，越来越多的研究表明，高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)可引起内皮细胞受损、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等病理生理变化，是导致动脉粥样硬化独立危险因素之一[2-4]。大量文献表明，HCY跟性别、年龄相关。本研究旨在采用横断面调查的方法，在校正了年龄因素后，分别对男性、女性脑梗死急性发作患者与血清HCY水平关系进行研究，以进一步明确血清HCY在脑梗死发生中的意义。
2013&Vol. 28&(3):&257-258
技术研究与评价.论著
吴学兵1，陆彬2，桂晓虹3，江渊3，张国英2，王宏2
液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估
目的 分别用液体分枝杆菌培养管（MGIT）培养法与固体罗氏(L-J)培养法及痰直接涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌，评估液体MGIT培养法在结核病诊断中的应用。 方法 收集上海市松江区中心医院2010年11月至2011年8月肺结核门诊及住院的疑似和确诊后治疗复诊的患者痰标本共1 598例，其中828例为疑似新发患者 、770例为已确诊治疗后复诊患者痰标本，所有标本均分别用液体MGIT培养法、固体L-J培养法及痰涂片抗酸染色进行检测。 结果 疑似新发患者痰液体MGIT培养法报阳时间[（13.63&7.14）d]与固体L-J培养法报阳时间[（28.67&10.04）d]间，复诊患者痰液体MGIT培养法报阳时间[（22.94&9.55）d]与固体L-J培养法报阳时间[（28.53&10.40）d]间差异有统计学意义（P＜0.05）；疑似新发患者痰液体MGIT培养法培养阳性率[32.00%(265/828)]比痰涂片抗酸染色法[14.80%(123/828)]和固体L-J培养法[17.90%(148/828)]高（P＜0.05），复诊患者痰液体MGIT培养法培养阳性率为9.30%(72/770)，痰涂片抗酸染色法为6.10%(47/770)，二者差异无统计学意义（P＞0.05），但比固体 L-J培养法[2.60%(20/770)]高（P＜0.05）; 液体MGIT培养法污染率为[6.57%(105/1 598)]，比固体L-J培养法[4.00%(64/1 598)]高（P＜0.05)。 结论 液体MGIT培养法在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于传统的检测方法，而且操作简便，不需要昂贵设备，在基层医院易于操作和推广。
2013&Vol. 28&(3):&211-214
胡尧，刘维薇，黄志基
中和确认试验在电化学发光免疫法检测乙型肝炎表面抗原弱反应性中的价值探讨
目的 对电化学发光免疫法（ECLIA）检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）弱反应性的标本进行中和确认试验，并对确认结果进行分析。 方法 筛选ECLIA检测HBsAg弱反应性（COI值在1.00～50.00之间）的100例标本进行中和确认试验，并对确认结果进行分析。 结果 100例HBsAg弱反应性标本经确认试验确认阳性87例（87.0%），阴性10例（10.0%），不确定3例（3.0%）。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示，当ECLIA检测HBsAg的COI值为1.97时，特异性可达100.0％，敏感性为83.9％。 结论 中和确认试验可作为HBsAg弱反应性标本进一步确认的手段；ECLIA对弱反应性HBsAg检测敏感性高，特异性好；当ECLIA检测HBsAg的COI值＞2.00时，一般可以排除假阳性的可能，无需进一步做确认试验。
2013&Vol. 28&(3):&218-220
颜善活，孙雷，符可鹏，卓永光，杨善业，樊祖茜，黄永霞
实时荧光定量PCR快速诊断肺炎链球菌
目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应（PCR），用于肺炎链球菌检测和流行病学调查。 方法 以肺炎链球菌自溶素(lyt)和溶血素（ply）的基因为目的序列分别设计引物和探针，将其分别与10株肺炎链球菌、13株非肺炎链球菌DNA以及不同浓度梯度的肺炎链球菌DNA进行荧光定量PCR，并将引物和探针应用于200例临床标本检测，同时通过传统的微生物培养鉴定的方法来验证荧光定量PCR的特异性和敏感性。 结果 10株肺炎链球菌均获得了明显的扩增产物，13株非肺炎链球菌DNA无明显的扩增信号，其检测敏感性可达100 fg；200例临床标本，实时荧光定量PCR检测出42例肺炎链球菌阳性(阳性率为21％)，而培养法阳性16例(阳性率为8％)。 结论 实时荧光定量PCR是一种敏感、特异、快速的检测肺炎链球菌方法，可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查
2013&Vol. 28&(3):&221-224
汪骅1，韩崇旭1，王惠民2，金庆辉3，王大新1，曹丽1，董兰梅1
基于纳米技术的芯片电泳快速检测脂蛋白及其亚型的研究
目的 建立芯片电泳分离血清脂蛋白及其亚型的方法并初步探讨其临床应用价值。 方法 利用自制的微流控芯片，选择Tricine 缓冲液作为电泳缓冲液，纳米金作为添加剂，分离经硝基苯并噁二唑-C6-酰基鞘胺醇（NBD C6-ceramide）预染的脂蛋白，激光诱导荧光技术检测。探讨不同颗粒大小、不同浓度的纳米金对脂蛋白分离的影响，选择最佳的电泳条件；确定芯片电泳分离血清脂蛋白的线性范围、检测限和重现性；采用芯片电泳分析35例冠心病（CHD）患者与30名健康体检者（对照组）的血清脂蛋白。 &结果 在缓冲液中添加20 nmol/L 5 nm纳米金，大而轻低密度脂蛋白（lLDL）、小而密低密度脂蛋白（sdLDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）和高密度脂蛋白（HDL）在3 min内实现基线分离；在优化的分离条件下，lLDL、sdLDL、VLDL和 HDL芯片电泳的线性范围[信噪比（S/N）＝3]分别为0.01～0.8、0.04～1.0、0.04～1.0、0.02～0.8 mg/L；检出限分别为5、5、15和 8 &g/L。对健康体检者的血清样本连续测定5次，lLDL、sdLDL、VLDL和HDL的峰面积相对标准偏差（RSD）为分别3.5%、2.2%、4.5%、3.9%。CHD组sdLDL与VLDL水平增高，HDL水平降低，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01、P＜0.001)。 结论 基于纳米技术的芯片电泳可快速、简便地测定脂蛋白及其亚型，对评价CHD的危险因素，实现对CHD的早期检测、预防及有效制定CHD防治策略具有重大意义
2013&Vol. 28&(3):&225-228
陈永秀1，周云珍2，陈锦宏3，李树全4，龙桂芳4
两种电泳方法血红蛋白分析一致性的比较
目的 比较琼脂糖凝胶电泳与醋酸纤维素薄膜电泳血红蛋白检测结果的一致性。 &方法 同时采用Sebia Hydrasys LC全自动琼脂糖凝胶电泳系统和醋酸纤维素薄膜电泳（pH值8.6）对4 126例进行地中海贫血筛查的样本进行血红蛋白各组分的检测。用分光光度计比色测定HbA2、HbH、HbBart&s含量，用碱变性试验检测HbF含量。对2种电泳方法的检测结果进行对比，不一致的样本采用基因分析确诊。 结果 4 126例样本中琼脂糖凝胶电泳共检出&-地中海贫血686例（HbA2和/或HbF增高）、&-地中海贫血321例（HbA2降低）；醋酸纤维素薄膜电泳检出&-地中海贫血683例、&-地中海贫血 323例。2种电泳方法对HbA2和HbF区带的检测能力基本一致。琼脂糖凝胶电泳检出HbH 103例、HbBart&s 71例、HbCS 63例；醋酸纤维素薄膜电泳检出HbH 141例、Hb Bart&s 101例、HbCS 65例。经基因分析确诊，琼脂糖凝胶电泳漏检HbH 38例、HbBart&s 30例、HbCS 2例。 结论 琼脂糖凝胶电泳可准确检出HbA?2和HbF区带，对HbH、HbBart&s区带的检测能力不足。当HbA2降低、异丙醇试验阳性、红细胞脆性试验（一管法）阳性时需用醋酸纤维素薄膜电泳进行检测并定量测定HbH、Hb Bart&s值。在筛查和普查地中海贫血时可使用电泳方法，但在临床确诊和产前诊断时必须采用基因分析。
2013&Vol. 28&(3):&229-232
UF-500i尿液有形成分分析仪在孕妇尿液检测中的应用
目的 探讨SYSMEX UF-500i全自动尿液有形成分分析仪（简称UF-500i）在孕妇尿液有形成分检测中的应用。 方法 采用UF-500i和显微镜检查法分别检测22 434份孕妇尿液标本，并对二者结果进行比较。 结果 UF-500i对检测白细胞和小圆上皮细胞有较好的替代性；检测红细胞、病理管型时假阳性率较高，分别为13.3%和10.2%；检测结晶和酵母样菌时假阴性率较高，分别为20.6%和25.4%。 &结论 利用不同方法检测结果的互补作用，既可提高工作效率，也有助于提高检验质量。
2013&Vol. 28&(3):&238-240
基础研究.论著
何绿茵1，陈林强1，陈业辉2，仉智2，林华欣2，李淼沅2，徐邦牢1
钙调磷酸酶类免疫抑制剂大鼠模型尿液中尿酸、肌酐及葡萄糖的变化
目的 观察尿量及尿液尿酸（UA）、肌酐（Cr）、葡萄糖（Glu）含量在肾移植术后首剂治疗剂量钙调磷酸酶类免疫抑制剂大鼠模型中的变化。 方法 将SD大鼠24只随机分为对照组、环孢素A（CsA）组、他克莫司(FK506）组和FK506＋地尔硫卓(Dil）组，每组6只。其中CsA剂量为25 mg&kg－1&d－1、FK506剂量为0.8 mg&kg－1&d－1、Dil剂量为8 mg&kg－1&d－1。用药4周后建立起各组大鼠模型。观察实验2周及4周时各组大鼠的尿量，并检测尿液UA、Cr、Glu含量。 结果 实验2周时，CsA组尿量明显多于其他3组（P＜0.05）；实验4周时，4组尿量差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验2周及4周各组之间尿UA含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验2周时，FK506组尿Cr含量高于对照组和CsA组（P＜0.05），但与FK506+Dil组差异无统计学意义（P＞0.05）。实验4周时，CsA组、FK506组和FK506＋Dil组尿Cr含量均明显低于对照组（P＜0.05）。实验2周及实验4周时，CsA组的尿Glu含量明显高于其他3组（P＜0.05）。 结论 治疗剂量的钙调磷酸酶类免疫抑制剂可致大鼠尿Cr及Glu代谢紊乱。
2013&Vol. 28&(3):&240-242
综述与讲座
金巧智1 综述，蔡志毅2 审校
DNA主动去甲基化相关通路的研究进展
对于DNA去甲基化的研究以往都是以DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）为靶向分子，通过抑制DNMT来恢复抑癌基因的功能，从而达到治疗肿瘤的目的。去甲基化药物就是通过抑制DNMT的活性使复制后的DNA不能再次甲基化，从而导致所有等位基因表现为去甲基化，使抑癌基因得以恢复表达，抑制肿瘤的生长。虽然去甲基化药物的出现将肿瘤的治疗带到了一个新的高度，但是仍有很多问题亟待解决，比如DNA去甲基化的确切机制及其靶向特异性。目前研究发现DNA去甲基化主要有两种方式：一种是在原生殖细胞和早期胚胎中都可以发生的主动DNA去甲基化[1]，这一过程不依赖于DNA复制，受酶的催化，使5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)转化为未甲基化的胞嘧啶；另一种是通过与复制相关的过程发生的被动DNA去甲基化[2]，即在DNA复制时，DNA甲基化模式的维持受到干扰，没有保留原有甲基化模式，随着复制的进行，甲基化的CpG岛被&稀释&，导致DNA去甲基化。?尽管在很多细胞进程中都存在DNA主动去甲基化，但是关于主动去甲基化的潜在机制仍存在很多争论[3]。目前研究发现DNA主动去甲基化可能涉及到的通路有6个，即5mC脱氨基化与BER偶联通路、碱基切除修复（base excision repair，BER）通路、5mC甲基团脱氢通路、核苷切除修复（nucleoside resection repair，NER）通路、水解反应直接去除甲基团、5mC氧化去甲基化[3-5]。与这些通路相关的酶和因子有：胞嘧啶脱氨酶：AID，APOBEC1[6-7]；TET蛋白：TET1，TET2等[8-9]；延伸复合物蛋白：ELP1，ELP2等[10]；碱基切除修复蛋白：RNF4，TDG等 [11-13]；核苷酸切除酶：GADD45a，GADD45b[14-15]；DNA甲基转移酶：DNMT3a，DNMT3b；DNA糖基化酶：EME，DML2等[16-17]。但其中哪个或哪些具有真正的DNA去甲基化活性尚待验证。本文综述最新文献资料，介绍其中主要通路及其相关的酶和因子。
2013&Vol. 28&(3):&243-247
徐怡1，陈光明2，宓现强2
miRNA在肿瘤早期诊断中的价值及其检测技术进展
恶性肿瘤是一种死亡率很高的疾病，2005年全球死亡人数5 800万中死于癌症的760万，占总数13%[1-2]。据世界卫生组织最近发表《世界癌症报告》说，今后数年将是全球癌症高发年份，如各国不采取紧急措施，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增患者人数将达1 500万人。解决肿瘤高死亡率的途径之一是对肿瘤进行有效的控制和预防，而控制和预防最大的难题是如何能尽可能早的发现肿瘤，从而针对性的采用最有效的手段进行治疗。?肿瘤患者死亡率的不断升高，使得越来越多的研究人员致力于肿瘤研究，在其诊断和治疗方面取得了不少进展，其中肿瘤诊断方面，miRNA作为一种新的肿瘤标志物是肿瘤诊断研究的热点。
2013&Vol. 28&(3):&248-251
韩丽乔 综述，庄俊华，黄宪章 审校
质谱技术及其在临床检验中的应用
质谱（mass spectrometry，MS）技术是一种重要的检测分析技术，通过将待测样本转换成高速运动的离子，根据不同的离子拥有不同的质荷比（m/z）进行分离和检测目标离子或片段，然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量[1]。近年来，质谱技术发展迅速，通过改进离子源和分离器相继发展了多种类型的质谱仪如电喷雾离子源质谱（ESI-MS）、大气压化学电离离子源质谱（APCI-MS）、四级杆（QQQ）质谱仪、离子阱质谱技术以及各种串联、联用质谱仪等多种类型，极大提高了检测的分辨率和检测范围。质谱技术最先应用于计量和分析化学领域，在临床检验中质谱仍属于一种年轻的检测方法。但自从其在临床检验应用以来，便以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力，尤其和气相、高效液相色谱仪的联用极大的扩展了质谱技术在临床检验中的分析范围。
2013&Vol. 28&(3):&252-256
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