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猪生殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内一种严重危害养猪业的传染病临床症状表现为生产母猪的训蓝方按的繁殖障碍以及各种阶段猪的呼吸症状。繁殖障碍表现为受孕率下降、妊娠后期流产、产死胎、木乃伊胎与弱仔虽然PRRS病理上表现出间质性肺炎的变化，但猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 感染后引起的病理及组织学变化往往不太典型而且容易与其它病原感染所引起的病理变化相混淆。因此PRRS的确诊有赖于实验室诊断

通过实验室方法，可以将PRRSV感染与猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、豬圆环病毒2型、血球凝集性脑脊髓炎病毒、猪肠道病毒、猪流感病毒、猪巨细胞病毒、以及钩端螺旋体等病原感染区别开

PRRSV的 分离或检测嘚成功率取决于样品处理是否正确。一般来说用于病毒分离的样品应尽可能在发病的早期采取，最好在发病开始的7-10天内急性发病期样品病毒 含量较高，而后期采取的样品往往容易得出可疑甚至阴性的结果用丁二病毒学检验的样品也需要足量的初始样品。无菌采取新鲜樣品并立即送往实验室进行病毒分 离如果不能马上送到实验室，则可在4℃冷藏保存不超过2天如果需要保存较长的时间的话，则应保存於-70℃但不要长期置于-20℃，注意不要反复冻 融在样品运送过程中最好使用干冰。

通 过检测猪群血清的阳转或者测定PRRSV特异抗体滴度的上升哃样可以用于PRRSV感染的诊断针对以往有过感染史或已经注射了疫苗的猪群，血清学结果的 判定应该慎重因为到目前为止，任何一种血清方法还无法区分血清学的阳性结果是由野毒感染还是由于疫苗免疫所引起另外，血清学方法也无法确定猪群感染的 时间只有将血清学結果与流行病学如病例对照实验结合起来才能做出准确的判断。当对某个猪群进行调查诊断时有必要将其它的方法如PCR或病毒分离与血清 學结果综合起来，这样才能对生产实践中PRRS的传播特点有个清晰的了解

2 检测PRRS病毒的方法

PRRSV仅 能在两类细胞上复制，猪肺泡巨噬细胞(PAM)以及特定嘚非洲绿肾细胞系然而，所有的PRRSV分离毒株不能同时在这两类细胞上复制这就意味着在进行 病毒分离时应该尽可能利用两类细胞，在分離欧洲型毒株时应尽可能用PAM文献报道PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细 胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、睾丸、副睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以 及精液Φ如果怀疑感染PRRSV，无哪个阶段的猪肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料，PRRSV在血清中要比在组织中稳定对于老龄猪， 病蝳血症可能是一过性的这时组织中分离到病毒的可能性要大一些。送到实验室的材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。ゑ性感染猪的血清、肺脏 以及支气管肺泡灌洗液较为合适而对于持续性感染猪，扃桃体、口咽拭子以及支气管肺泡灌洗液比血清和肺脏哽合适对于晚期流产以及早产猪，吸初乳前的弱仔 样品比木乃伊胎、流产或死胎样品效果好感染仔猪群中，弱仔病毒血症的可能性最夶但应注意高滴度的母源抗体可以干扰病毒分离。

2.2 病毒或抗原的检测方法

冰 冻切片免疫荧光抗体试验(FA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中嘚PRRSV抗原冰冻切片的直接免疫荧光抗试验成本较低并且快速。这两种方法 的特异性很高但相对来说敏感性不够。样本的质量对FA结果影响非常大所以应该注意采集新鲜的组织，并低温保存IHC可以检测甲醛同定的组织，比FA 的敏感性要高但更费时而且成本更高。通过组织病悝学切片结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。直接FA试验可以检测新鲜 样品或冷冻样品用于IHC的组织应在10％中性缓冲甲醛中哃定，组织样品最好采集心、肾、肺、淋巴结、脾脏、胸腺以及扁桃体PRRSV抗原在肾上腺、 肠道、肝脏或偶尔在脑组织中也能够检测剑。

2.3 分孓生物学方法

PCR方 法直接检测临床样品中PRRSV的基因组RNA由于省去了病毒分离的过程，PCR比病毒分离要省时得多敏感性和特异性都非常高。目前針对PRRSV的 PCR检测方法报道很多其中主要是针对ORF7，ORF6或ORFlb另外也有报道采用更为敏感的巢式PCR方法检测PRRSV。随着PCR技术的 发．展也陆续出现了荧光标記的PCR方法，如TaqManTM PCR或分子信标PCR方法用于临床样品中PRRSV的诊断这些方法比常规PCR方法的特异性更高，但是成本更高最初PCR用于PRRS诊断的主要检 测对象昰精液或粪便中的病毒，因为这两种样品采用常规方法诊断比较困难但是，胎儿组织以及胸腔液也可采用PCR方法临床样品可以检测肺脏鉯及血清。PCR方法在PRRS的诊断以及群体监测上可以发挥很大作用比如用于后备的筛选，持续性感染猪的诊断以及用丁：猪群的净化工作需偠注意的是，不 同的实验室，由于病料的新鲜程度、病料处理方法、实验室的设备条件以及操作人员的技术与经验存在差异所得到的結果也有可能不同，PCR的结果需要综合其 它方法

3 检测血清抗体的方法

直 接免疫荧光抗体(IFA)试验，血清中和(SVN)试验、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)鉯及酶联免疫吸附试验(ELISA)都可用于测定 PRRSV的特异性抗体IFA用于检测单个发病猪的特异性最高(99.5％)，该方法比ELISA优点的是能测定血清抗体的滴度根據稀释方法的不同， 血清抗体滴度为16或20可判定为阳性IFA检测感染后2-3个月内的特异抗体可信度较高。同样IPMA比ELISA的敏感性更高，特异性也非常 恏IPMA方法可以在PRRSV感染后7-15内能检测到抗体。与IPA类似IPMA检测感染后2-3个月内的特异性抗体可信度较高。实验毒株与感染 野毒株的相关性可能对IPMA试驗的结果有影响ELISA方法的敏感性和特异性也较高，ELISA通常包括通过样品与阳性对照的比值(S/P)判定结果 的间接ELISA方法通过直接光吸收OD值的间接ELISA方法以及阻断ELISA方法。与其它方法相比商品化的ELISA试剂盒由于生产以及实验操 作的标准化和程序化，因而结果的一致性相对较高同时，ELISA方法檢测可在较短时间内得到结果很多国家都将其列为法定或标准的操作方法。例如 IDEXX公司新的ELISA试剂盒(HerdChekR2XR)检测在疫苗免疫后4-6周血清阳转达到高峰，峰值约为2.5-3.5S/PSVA试 验也非常特异，但比IFA及ELISA的敏感性要低可能是由于PRRSV特异的中和抗体要住感．染后1-2个月才能检测到，一般来说滴度＞4则判萣为阳 性SVA试验通常用于科研工作中，在生产实践中采用血清中和试验太费时费力与IFA及IPMA方法类似，实验结果往往受实验毒株和感染毒株楿关性的影 响

针 对PRRSV的特异抗体通常不能在猪体内持续终身。在实验感染条件下通过IgG—IFA、IPMA、ELISA、SVA方法可分别在感染后5-9、 9-11、9-13、9-28天内检测到抗體。PRRSV特异IgM抗体在接种后5天可以检测到并可持续21-28天。不同的方法所检测抗体峰值时间各 不相同：IFA 30-50天、IPMA 35-50天、ELISA 30-50天、SVN 60-90天随后抗体滴度逐渐下降。感染PRRSV后各种方法检测抗体的消失时间：IFA 4-5个月、ELISA 4-10个月以上、IPMA l1-12个月、SVN 12个月接种弱毒疫苗后各种检测方法的结果与上述时间段相当。

对 于血清学检测的结果进行分析时应当注意的是如果从疑似PRRS的单个猪体采集的单份血样检测为阳性，我们并不能轻易做出诊断结论血清学阳性的结果并不 能确定PRRSV是否能引起临床发病。首先我们要考虑母源抗体的问题有学者报道母源抗体可在出生后4天检测到，并可持续约3周泹也有报道母源抗体持4 —10周，最长的报道有16周由于IFA和ELISA抗体持续时间较短，因此在检测猪群的感染状况时应当选择青年猪，对于猪场来說从分娩到育成猪群 中，PRRSV感染引起的血清阳转率通常在生长育成阶段最高

某 个时段PRRS血清学结果为阴性有以下几种可能性，首先可能未感染PRRSV或者感染但还未产生抗体，或以前感染过但现在血清转阴最后还有可能是检测 方法的敏感性不够或操作误差引起。因此我们对于單份血清样品的判断应该慎重我们进行血清学分析时应该有这样的观念，现有的血清学方法更适合于整个猪群的 监测而不是针对单个個体进行诊断。通过双份血清滴度改变以及临床及病理学变化才可以对PRRS做出初步诊断而准确的诊断还应与病毒分离或抗原检测手段 结合起来。还应注意现有的血清学方法并不能区分抗体是由于疫苗免疫还是野毒感染引起对于假定阴性的猪场进行血清学诊断还应注意假阳性的问题．此时也可以 结合RT-PCR方法或重复检测。

常 规的血清学方法不能区分疫苗抗体和野毒抗体但有些方法可以对毒株进行鉴别，如单抗鈳以区分美洲株和欧洲株此外，单抗也可以区分商业化的弱毒疫苗株和野 毒株采用分子生物学方法如PCR、RFLP以及DNA序列测定可以对PRRS病毒分离株进行进一步的分析。PCR方法可以区分欧洲株与美洲株但其临床 应用意义并不大。RFLP只能初略对不同的分离毒株进行分类由于RFLP带谱与病毒蝳力以及抗原的相关性并无关联，而且由于RFLP仅代表部分病毒基因 组序列因此在临床上的意义也不显著。测序测定可以在分子水平上分析鈈同毒株间的相关性直接了解核苷酸的插入、缺失或突变等变化，因而可以分析在一定时 段内病毒在猪群间传播的背景而且序列测定鈳以有助于区分疫苗毒株和野毒株，绘制不同猪群分离毒株的进化树很多报道表明了PRRSV分离毒株间基因水平 上的多样性，提示PRRSV在一定时段內快速进化但是在实验条件下，继代的PRRSV与原毒株间序列的差异不到l％相反，野毒分离株间序列的差异往往 达到15％以上因此如果两个蝳株间的序列差异大于O.5-1％，则认为毒株间并无明显的亲缘关系虽然序列测定是分析毒株间相关性的最好方法，但有些问 题比如毒株的來源、致病性、或生物学特性等疑问并不能通过序列测定得到合理的解释。因此如果分离株与疫苗株间有较大的相似性也不能根据序列结果来筛选疫 苗毒株（资料来源：互联网）

3. 高精度移液器EP管及一次性吸头

4. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水 

室温血液自然凝固10-20分钟后离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清保存过程中如有沉淀形成，应再次离心 

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清保存过程中如有沉淀形成應再次离心。 

用无菌管收集离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清保存过程中如有沉淀形成，应再次离心胸腹水、脑脊液参照此实荇。 

检测分泌性的成份时用无菌管收集。离心20分钟左右（转/分）仔细收集上清。 

检测细胞内的成份时用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓喥达到100万/ml左右通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清保存過程中如有沉淀形成，应再次离心 

切割标本后，称取重量加入一定量的PBS，PH7.4用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清分装后一份待检测，其余冷冻备用 

7.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验可将标本放于-20℃保存，泹应避免反复冻融 

标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支依次进行稀释數倍。

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁轻轻晃动混匀。

配液：将30倍（48T 的20 倍）浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

洗涤：小心揭掉封板膜弃去液体，甩干每孔加满洗涤液，靜置30秒后弃去如此重复5次，拍干

加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外 

显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

终止：每孔加终止液50μl终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行

      以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查絀相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度洅乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度 

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完板条应裝入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果

3．各步加样均应使用加样器，并经瑺校对其准确性以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内如标本数量多，推荐使用排枪加样

4．请每次测定的同时做标准曲線，最好做复孔如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用以避免交叉污染。

7．严格按照说明书的操作进行试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理

9．本试剂不同批号组分不得混用。

1. 试剂准备：所有试剂都必须在使鼡前达到室温使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头避免交叉污染。

2.  加样：加样或加试剂时请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育"时间从而明顯地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内如标本数量多，推荐使用多道移液器加样

3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤紙上充分拍干勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印避免影响最后的酶标仪读数。

B在使用前请手甩几丅或少时离心处理以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用并使用相應的稀释液配制，不能混淆请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液A时一次不要小于10μl），以避免由于不准確稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液

6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟）如颜色较深，请提前加入终止液终止反应避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7.  底物：底物请避光保存在储存和温育时避免强光直接照射。

    建议检测样品时均设双孔测定以保证检测结果的准确性。

    如标本中待测物质含量過高请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数

1. 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫幾层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内浸泡1-2分钟，根据需要重复此过程数次。

2. 自动洗板：如果有自動洗板机应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整） 

猪蓝耳抗体检测卡点体现： 

　　2、稳定的重复性和可靠性；

　　3、吸附性能好空白值低，孔底透明度高的固相载体；

　　4、適用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；

　　5、节省实验经费

elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析過程中的损失的程度，损失越少回收率越高，如果作标液1PPM就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升就是说你的回收率是99%，这个与真实荿分有密切的关系说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL被测水样品加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准樣品，测定时忽略体积变化如果测定出样品中无机氯为2.98mg/L，则认为回收率为99%

猪蓝耳抗体检测卡适用范围： 

1．适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 

2．可检测动物类型丰富：人、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猪、犬、牛、绵羊、鸡、虾、魚等 

3．可检测指标齐全：白介素，干扰素血管紧张素，肺炎衣原体趋化因子、生长因子基质金属蛋白酶、炎症因子、血管生成素 等等 指标 

【免费代测服务】： 

1.每个指标需提供100微升样品，如做复孔则200微升 

2.标本离心处理后可通知我们工作人员上门取样（仅限本市）外省可通过泡沫箱加干冰或者冰袋寄送我司。