检测14502leberr病线粒体T3394C试剂盒的制作方法
[0001] 夲发明属生物技术领域设及用于检测与14502leberr病相关的线粒体DNAT3394C突变 的试剂盒,还设及一种与14502leberr病相关的线粒体基因突变的检测方法特别设及检測线粒 体MVT3394C突变的方法,W及上述方法或上述的试剂盒在检测与14502leberr病相关的线粒体 DNAT3394C突变中的应用
[0002] 14502leberr遗传性视神经病变化eber'SHereditaryOpticNeuropathy,LH0N,简称 14502leberr氏病)是一种母系遺传性视神经病变主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束 纤维,导致视神经退行性变的母系遗传病严重的影响着人们正常的生產、生活。根据国家 卫生部(/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万盲人 约有500万,占总人数的0. 4%成为世界上视力损伤最严重的国家の一。其中由视神经病 变引起的约为55万。1871年德国眼科医生化eodor14502leberr首次报道该病的临床症状、体征 和遗传特性1972年化ickson等发现LH0N的遗传方式呈典型嘚母系遗传特征。1988年 MWT14502C突变与LHON相关与线粒体相关的原发性14502leberr氏病在早期临床症状不明显, 早期的检查常常会因此被耽误尤其在我国偏远农村地区,该种情况普遍存在因此,在高 危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查对于预防和控制与线粒体相关的原发性14502leberr 氏病的发生有着极其偅要的作用。
[0003] 自发现与mtDNA突变相关的疾病W来检测线粒体突变位点的检测方法主要还是 序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准但该操作繁琐,费用昂贵限制了它的广泛应 用
[0004] 近年来,国内相继报道了14502leberr遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测 方法W满足对线粒体突變突变进行广泛筛查的需要,如福建医科大学于2005年申请了 的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号;.8)该发明是根据90%W 上的14502leberr氏遗传性视神經病变患者的线粒体DM突变属于3个原发性致病位点突变 (G11778A、G3460A和T14484C),设计和合成位点特异性PCR引物直接W全血样作PCR的 DNA模板,利用等位基因特异性多重PCR技术单管一次性PCR反应,同时检测LH0N患者的 线粒体DNA的3个原发性致病突变位点具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量 血液样本等优点,为LH0N患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒 具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大实验中 采取的多重PCR的条件要求将会增加,检测方法跟普通的方法没有本质的区别2006年 杭州优思达生物科技有限公司建立一種W单核巧酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体 DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号;. 1)。在应用单核巧酸多态性核 酸检测试纸条进行多态位点或突变位點的检测时需要设计一条特异性延伸引物,该条引 物的3'端碱基紧临多态性碱基或突变碱基其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗 原标記与模板对应的双脱氧单核巧酸(ddNT巧被连接到延伸引物上虽然该方法能够实现 短时间内的检测阳性位点,但PCR扩增条件严格存在假阴性嘚几率大大增加。
[0005] 本发明的目的是针对目前检测MVT3394C突变的方法所存在的缺点提供一种快 速、简便、准确、经济的检测14502leberr病相关的线粒体DNAT3394C突变嘚试剂盒。
[0006] 本发明提供的试剂盒由DNA提取混合液、扩增T3394C片段的PCR混合液、针对 T3394C设计的一对外引物、针对T3394C设计的一对内引物、限制性内切酶、陽性对照、阴 性对照组成。其中提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酪、无水酒 精组成;扩增T3394C片段的PCR混合液试剂包括dNTP(脫氧单核巧酸)、10XPCR缓冲液、
[0007] 在上述试剂盒中,在扩增T3394C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的 少许二甲基亚讽(0.1-0.2y1为宜) 本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与14502leberr病相关的线粒体基因 您/T3394C突变中的应用通过W下步骤实现: (1) 基因组DNA的提取:运用蛋白酶K消化裂解法,从少量嘚血液标本、带毛囊的毛发、 口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA; (2) 特异性PCR扩增;使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQIDNO: 5所示 的人类线粒体基因序列所设計的引物F% /R%、Fh/Rh是能扩增出包含上述14502leberr病的线粒 体突变位点的片段F外/R外扩增出为线粒体DNA的核巧酸,其序列为序列表中 的SEQIDN0:1、2;F内/R内扩增出为线粒体DNA的核巧酸,其序列为序列表中 的沈QIDN0:3、4 (3) 酶切鉴定;将上述PCR产物用限制性内切酶魁eI对T3394C突变位点处进行酶 切; (4) 突变检测;聚丙締酷胺凝胶电泳检测,矗接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量 及DNA片段大小检测mtDNA是否发生T3394C突变。
[0008] 在上述检测mtDNAT3394C突变的方法中可从血标本巧日一滴血)、带毛囊的毛发、 ロ腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA,根据取样方式或被测样本形式不同对 不同样本进行相应的预处理,处理方法如下: (1) 血标夲巧日一滴血);取20~200y1少量血标本巧日一滴血)或1cm2的血滤纸片放 入1.5mlEP管(离屯、管)加入900yl红细胞裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl,抑7.6)(S 哲甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液)室温静置lOmin充分裂解红细胞,12000巧m离屯、Imin收 集白细胞沉淀; (2)带毛囊的毛发:用70%己醇洗带毛囊的毛发1次,后再用蒸馈水冲洗毛发2次在 1.5ml EP管中汾别放入2~4根毛发,毛囊置于EP管底部用干净的剪刀剪去毛发高于EP 管的部分; (3) 口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前,必须让被收集者漱口W除詓口腔中过多的老 化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟然后开始收集口 腔粘膜刮片或唾液,可視条件选择如下方法收集唾液样本;①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞 将约0. 1ml唾液直接吐进EP管内;②生理盐水漱口,吐进EP管内吸取PBS溶液至装囿通 过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中,反复吹打后12000rpm离屯、5min,除去上清 重复该过程一次;⑨用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次,空氣中干燥然后用灭菌过的綴子小 屯、撕去其外表面,放入EP管中;④将唾液吐在滤纸上空气中干燥后形成唾液斑,再用干净 的剪刀剪成夶小约1cm2碎纸片置于EP管中
[0009] 然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解,利用盐析法去除蛋白等 杂质异丙醇沉淀DNA,最后用高压灭菌水溶解后于-20°C保存备用
[0010] 在本发明的实施方案中,引物设计的指导思想是针对mtDNA T3394C位点存在的 位置相邻近,扩增在一条片段上故应设计3'末端与3394位点野生型T和3394位点突变 型C相对应的上游引物;针对3394位点设计3'末端分别与3394位点野生型T和3394位 点突变型C相对应的下游引物。(参照图1) 本发奣人针对特异性PCR扩增后(图2)mtDNAT3394C位点形成了酶切位点。酶切位 点是由mtDNAT3394C突变形成的其中的限制性内切酶为MeI,其位点处为序列表中的 沈QIDN0:3、4 ; 用W上設计的引物W相应的被检测样本的DM为模板,通过PCR扩增后分别获得明亮 清晰的大小约2nbp的恒定扩增带3394突变位点对应于扩增片段的第155位。
[0011] 在上述检测线粒体基因14502leberr病突变的方法中结合特异性PCR技术和酶切技术, 每份DNA样本分别用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行普通PCR扩增然后进行突 变位点处的酶切,通过一次PCR便可在几小时内检出14502leberr病相关的mtDNA T3394C突变
[0012] 理论上,基因组DNA样本经一次PCR反应即体系中仅加入针对突变型位点T3394C 引物F/R後,加入针对突变位点新形成的限制性内切酶MeI进行酶切就可进行检测。也 就是说同一基因组DNA样本经一次PCR-酶切,从而使检测结果更为准確、可信
[0013] 本发明人还根据本发明中设计的引物序列,通过人工合成(委托生物公司)获得引 物并将引物按一定的比例混合,与提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标 本对照、阴性标本对照W及使用说明书组合起来制成了用于体外检测母系遗传14502leberr病 线粒体基因mtDNAT3394C突变的試剂盒,使得样本DNA提取、特异性PCR扩增和酶切可W 在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成其中,提取样本DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶 液I(主要荿分是蛋白酶K)组成;PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、S 蒸水和Taq酶限制性内切酶包括限制性内切酶MeI。
[0014] 用本发明的方法及其制备的体外检测14502leberr病楿关的线粒体基因mtDNAT3394C 突变试剂盒具有W下特点: 1.传统上获得14502leberr病患者基因组DNA的方法是从血液中提取每人大约需要3~ 5ml。该种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害而且在跨地区传递 样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法从少量的血液标夲巧曰一 滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不
14502leberr遗传性神经病变线粒体dna突变位点檢测的发病机制及研究