蓝白斑筛选没有菌落时,白色菌落很少或没有,请分析原因

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求助蓝白斑筛选,只有白斑没有蓝斑
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高手过来看一下吧,把一段基因转化到T载体中,同时蓝白斑筛选,只有白斑,没有蓝斑,而且在过夜生长16h后,菌落数很少,小于十个。上一次实验的时候也使这样的。帮忙分析一下原因吧。
& && & 还有昨天做这个实验的时候,根本就没有长出菌落,后来分析,可能是x-gal终浓度有问题,后来采用的终浓度是40ug/ml。(从20mg/ml的x-gal中吸取2ul加入到100ul的LB培养基中)。
& &&&高人指点一下迷津吧。
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没有做对照么?
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我们的实验也遇到了类似的情况,本来是1.5k的片段,检验到的却是750bp的。郁闷啊,不知道哪有问题。
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分享一下自己的经验:连T载体之前可以试下单独的加A反应,还有片段的量不用太多参考说明书的量就可以了。实验顺利的时候我们不用蓝白筛选直接挑阳性菌落做PCR,也没有问题,当然手气背的时候另当别论呵呵
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问一下,若不长斑,为什么分析是X-gal终浓度的问题呢?会有影响吗?为什么?谢谢
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长不长斑跟x-gal浓度有啥关系啊,长斑那么少,要么没连接好,要么转化感受态有问题
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白斑有的大有的小 应该挑什么样的呀?
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是感受态没有做好吗?转化效率很低啊
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问题很可能出在质粒构建这个环节
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一般连接需要多长时间啊
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蓝白斑筛选问题
只有一些白斑带一点的蓝色?多谢当我进行 蓝白斑筛选的时候,请问这种现象是什么原因造成的,没有完全的白斑
提问者采纳
到菌种都排查一下吧。没有白斑的原因。从连接产物,要么是没连上,要么是没转化成功,其实也是蓝斑?我以前有见过带点蓝色的白斑?或者测序呢,那些带一点蓝色的白斑你有没有做菌液PCR呢那么
“我以前有见过带点蓝色的白斑,其实也是蓝斑”这个我不能同意,因为我在将带蓝色的斑涂开以后,就会是大部分的斑是白色的,一些是蓝色的。但单个的斑是由一个菌长起来的,为什么是蓝白的混合物呢。我挺不能理解的。
你还很追根究底呢,这点比我好。不过你我情况可能不同, 我当时把那种菌做了菌液PCR,没有我的结果。然后我师兄告诉的。根据你后续试验判断,可能是有的菌在生长过程中,发生了质粒的部分丢失。那有可能是菌种容易发生突变,要么是那个质粒不够好。先换个菌液试试
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其他2条回答
最常见的情况。
我做蓝白筛基本是这种情况:细菌养的时间长都会有蓝色
不过自连菌落的特别蓝
阳性的菌落培养时间长了微蓝:1.
插入片段较小 并且读码框能匹配
使半乳糖苷酶仍具有活性
构建失败2有没有特别蓝的斑
有一些特别蓝的斑。 你说的细菌养的时间太长是指多长,我的斑也就是过夜,而且其实是有一个斑是全白的,几个斑是带点蓝色的。 可能不是时间长的问题,也不是因为大肠杆菌能表达微弱的半乳糖苷酶。 还有没有其他的建议。谢谢
可能是基因突变,还可能要看你使用的父本和母本
蓝白斑筛选的相关知识
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出门在外也不愁一学生用蓝白斑做阳性克隆筛选,因为疏忽没有在选择性培养基中添加X-gal,结果长出的菌斑全为白色试问:(1)这些白斑是否全为阳性克隆,形成白斑的原理是什么?(2)如果不是,如何从这些白斑中选择真正阳性克隆
幽灵幻银qzy
1 不是.因为没有生色底物,阴性菌落虽然可以表达lacZ,但无法显色.2 全部转接至含X-gal的新鲜选择培养基上,培养后看是否为白色.要么以pcr法对所有菌落作鉴定.或者所有菌落转接至液体培养基扩增后抽质粒,看质粒大小.
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