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分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用


【摘要】 本文综述了国内近年来,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况,以期为蚊媒传
染病的防制、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考。
【关键词】 分子生物学技术;虫媒;传染病

虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病。
1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种,其中128
种对人有致病性[1]。我国法定报告的传染病中,虫媒病占
13种,蚊虫作为媒介,除了传播病毒性疾病外,还可传播
寄生虫病。这类疾病大都属于自然疫源性疾病,有一定的
地域性和时间性,发病率低、死亡率高,主要通过媒介的
控制进行防制[2]。近年来,随着分子生物学技术的研究和
发展,在医学领域的应用日趋广泛,并取得了重大进展,
作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制
等方面的应用综述如下。
1 常用的分子生物学技术[3]
1·1 核酸分子杂交技术
核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核
酸分子的碱基互补原则,在特定的条件下,双链解开成两
条单链,与异源的DNA或RNA (单链)复性,若异源
DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复
性时可形成杂交的核酸分子。杂交的双方是待测核酸序列
及探针。核酸探针可用放射性核素、生物素或其它活性物
质标记。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探
针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
分类:根据被测定的对象,分为Southern杂交和
Northern杂交;根据所用的方法,分为斑点(dot)杂交、
狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交;根据环境条件:分为液
相杂交和固相杂交。
1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)
是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互
补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照
半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合
成。通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩
增,同时新合成的DNA片段也可以作为模板,使DNA的
合成量呈指数型增长。
PCR各种应用模式:兼并引物( degenerate primer)
pcr、套式引物(nested primer) pcr、复合pcr (multiplex
pcr)、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr)、不对称pcr
(asymmetric pcr)、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr、加端
pcr、锚定pcr或固定pcr、玻片pcr、反转录pcr方法检测
rna、定量pcr。
1·3 DNA芯片
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列
(DNA microarray)。是采用光导原位合成或显微印刷等方
法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相
应处理的载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂
交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、
数量及序列,从而获得受检样品的遗传信。特点:具有通
量大,并行性、微量化与自动化等优点,但在实践中其研
究成本较高;方法标准化不足;配套软件不够完善。
2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用
2·1 疟疾
黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断,经标记后作探针,从
多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫。基因芯片在疟原
虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]、转录因子调控网
络[6]、疟原虫适应人体宿主机制[7]、疟原虫比较基因组杂
交分析[8]、恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻
击红细胞机制[10]等。
2·2 丝虫病
黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微
丝蚴,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴;用
于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性,镜
检血片结果亦为阴性。常规丝虫检测是在夜间采血,有资
料显示[12], SsP/PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患
者血样中的循环DNA,能用于周期性或夜间周期性丝虫病
的日间血检工作,从根本上改变了丝虫病的诊断、监测和
工作方式。
2·3 登革热病
郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登
革病毒,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行
分型鉴定,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型
登革病毒;也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流
感和登革热病毒[14]。长期受这种疾病困扰的地区将有望通
过这种技术的完善,获得有效的治疗和保护。


2·4 流行性乙型脑炎
丁淑军等[15]在临床诊断为乙脑的63份标本和非乙脑
病人的3O份标本中,用RT-PCR检测乙脑病人的阳性率
为67·6% ,非乙脑病人无一例阳性,显示了较高的敏感性
和特异性;张焕容[16]构建了伪狂犬病病毒、猪细小病毒和
乙型脑炎病毒(PRV-PPV-JEV)基因芯片,同步检测和
鉴别诊断了PRV、PPV和JEV。将这一技术应用于临床时,
可帮助鉴别诊断,使病人获得更多的治疗机会。


2·5 其它虫媒病毒病
胡玉洋等[17]用(TBEV)实时定量lhqMan PCR检测方
法检测森林脑炎病毒,证实该体系具有良好的特异性;任
瑞文等[18]用特异的套式RT-PCR能快速检测黄热病毒。
3 分子生物学技术在虫媒病防制的应用
3·1 疟疾
常规用解剖镜人工检查蚊虫的唾腺,一个专业技术员
每天能检查蚊虫数是有限的,黄炳成等[4]报道, DNA探针
在25只蚊中有1只感染蚊即可出现阳性反应。对同一批感
染蚊,常规解剖镜检法查189只蚊,蚊虫唾腺子孢子阳性
率为36%,而用探针杂交法检测同样的蚊虫,阳性率为
54·0%,表明DNA探针法的阳性率高于常规镜检法,这
一技术的推广将能改善输入性疟疾的监测和管理手段。在
疫苗研究方面已经完成基础研究工作,胥全彬等[19]构建了

一系列包含恶性疟原虫表面主要抗原及T细胞表位的融合
基因表达载体,制成更适合临床应用的DNA疫苗载体,预
示疫苗的研究将进入临床应用阶段。
3·2 丝虫
用DNA探针/PCR法,检测蚊体内的班氏丝虫,阳性
率为30·67%,人工解剖镜检阳性率为21·28%。在平均感
染度为1·6条幼虫/蚊情况下, 50只蚊虫中有1只感染蚊
即可被探针检出[20],这一点有助于低密度流行区或消灭丝
虫病后的监测工作。
3·3 登革热
白纹伊蚊是传播登革热的重要媒介,相关的研究主要
有遗传物质β-肌动蛋白[21]、蚊子在携带病原的过程中,
自身对病原体防御能力的防御素基因[22]。蒋力云等[23]在
登革热病患者发病3天的血清和在其家中采得的孑孓,用
NEST-PCR检测的结果均为登革病毒I型阳性,另一患者
发病11天后的血清和采集的孑孓,均未检出登革病毒。这
是否能做为输入性病源监测的指标还需要做更多的工作。
在媒介控制方面,完成了对白纹伊蚊细胞色素氧化酶P450
CYP6N3基因进行原核表达[24],构建了白纹伊蚊抗性品系
和敏感品系差异表达基因cDNA文库[25]。还有人做了白纹
伊蚊乙酰胆碱酯酶(AchE)基因片段序列分析[26],以期
进一步的研究乙酰胆碱酯酶与抗药性的关系;程凌鹏等[27]
发现一株新的浓核病毒(C6/36 DNV),能抑制登革病毒在
感染细胞中的复制,而登革病毒能促进C6/36DNV的致病
性,用萤光定量PCR方法测定受感染伊蚊体内病毒数量的
变化,证明C6/36DNV能潜伏在幸存下来的成蚊体内并且
能稳定地遗传给下一代,是一种极有前景的灭蚊和防治登
革病毒的生物制品。





3·4 流行性乙型脑炎
乙脑是目前能用疫苗预防的虫媒病之一,暴发型和脑
干型患者的病死率较高,神经系统的后遗症严重影响患者
日后的生活和工作,防制的重点在媒介的控制。刘卫滨
等[28]建立JEV的实时荧光PCR方法,初步应用于蚊虫媒
介的监测与检测分析,每100只蚊虫的研磨产物大概携带
乙型脑炎病毒的含量在10~1000PFU之间, TaqMan PCR
检测方法从蚊虫标本的研磨到结果的判定,最快能够在4 h
内完成。这对检疫、确定病媒和界定流行区域很有帮助。
4 展望
蚊子是很多种病毒的宿主,乙脑和登革热是严重危害
健康和生命的疾病,随着经济建设的发展,各地域人员的
流动性变化很大,无论是对传染源或媒介的管理,都带来
很大的困难,以往主要是根据发病率监测的结果来采取相
应的控制措施,对蚊媒的监测大多只是掌握密度的变化,
而应用DNA探针快速诊断技术,将有助于确定传染源、对
疾病实施动态的管理,对蚊媒的监测可实现在确认蚊虫携
带病毒时,才实施大面积的灭蚊技术,减少盲目使用杀虫
剂造成人为的环境污染。疟疾也是一种严重危害健康的疾
病,特别是恶性疟。传统的诊断方法是用人工镜检法,疟
原虫不同的生长时期有几种形态,外形的变化大、低密度
时更不容易被发现,检测工作量受限,而且检测结果的准
确性可因检测者的疲劳受影响;媒介的监测也受同样的困
扰,将各种不同时期的原虫和子孢子制成DNA芯片,可同
时检测疟原虫和子孢子,其结果更客观、效率更高。但分
子生物学技术对设备和操作技术的要求较高,成本也高,
普及推广还有一定的难度。分子是构成细胞的基本物质,
分子生物学技术的应用领域非常广泛,虫媒病的媒介种类
很多,就吸血昆虫而言,还有很大的研究空间;基于DNA
探针技术,可用于快速检测的还有传染病的快速诊断盒、
疾病的动态监测、虫媒的监测和进出口动植物的检疫等,
尽管分子生物学技术因为设备和条件的原因,广泛使用限
制,相信在不远的将来,人们将可以更多地感受到分子生
物学技术给工作和生活带来的变化。


参 考 文 献
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年48、1087·
[3]蔡文琴主编·现代实用细胞与分子生物学实验技术[M]·北
京:人民军医出版社, 5·
[4]黄炳成·光敏生物素DNA探针用于血内和蚊体内疟原虫的检
测[J]·实用寄生虫病·): 159-161·
[5] Wu Y, Wang X, Liu X, et al·Data-mining approaches reveal
hidden families of proteases in the genome of malaria para-
site·Genome Res, ) : 601-618·
[6] GissotM, BriquetS, RefourP, etal·PFMyb,l a Plasmodium falci-
parum transcription factor, is required for intra-erythrocytic growth
and controls key genes for cell cycle regulation, JMolBoi,l 2005,
346 (1): 29-42·
[7] Daily JP, LeRochKG, SarrO, etal·In vivo transcriptome ofPlas-
modium falciparum reveals overexpression of transcripts that encode
surface proteins·J InfectDis,
(7): ·
[8] Carret CK, Horrocks P, Konfortov B, et al·Microarray-based


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关于当今世界十大环境问题的综述
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